Vascularización eficiente de organoides renales mediante trasplante intracelomico en embriones de pollo
Summary
Aquí, presentamos un protocolo detallado para el trasplante de organoides renales en la cavidad celómica de embriones de pollo. Este método induce la vascularización y la maduración mejorada de los organoides en 8 días y se puede utilizar para estudiar estos procesos de manera eficiente.
Abstract
Los organoides renales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos contienen estructuras similares a las nefronas que se asemejan a las del riñón adulto hasta cierto punto. Desafortunadamente, su aplicabilidad clínica se ve obstaculizada por la falta de una vasculatura funcional y, en consecuencia, una maduración limitada in vitro. El trasplante de organoides renales en la cavidad celómica de embriones de pollo induce la vascularización por vasos sanguíneos perfundidos, incluida la formación de capilares glomerulares, y mejora su maduración. Esta técnica es muy eficiente, permitiendo el trasplante y análisis de un gran número de organoides. Este artículo describe un protocolo detallado para el trasplante intracelomico de organoides renales en embriones de pollo, seguido de la inyección de lectina marcada con fluorescencia para teñir la vasculatura perfundida y la recolección de organoides trasplantados para el análisis de imágenes. Este método se puede utilizar para inducir y estudiar la vascularización y maduración de organoides para encontrar pistas para mejorar estos procesos in vitro y mejorar el modelado de enfermedades.
Introduction
Se ha demostrado que los organoides renales derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) tienen potencial para estudios de desarrollo 1,2,3,4, detección de toxicidad 5,6 y modelado de enfermedades5,7,8,9,10,11,12,13. Sin embargo, su aplicabilidad para estos y eventuales propósitos de trasplante clínico está limitada por la falta de una red vascular. Durante el desarrollo del riñón embrionario, los podocitos, las células mesangiales y las células endoteliales vasculares (CE) interactúan para formar la intrincada estructura del glomérulo. Sin esta interacción, la barrera de filtración glomerular, constituida por podocitos, la membrana basal glomerular (GBM) y las CE, no puede desarrollarse adecuadamente14,15,16. Aunque los organoides renales in vitro contienen algunos CE, estos no logran formar una red vascular adecuada y disminuyen con el tiempo17. Por lo tanto, no es sorprendente que los organoides permanezcan inmaduros. El trasplante en ratones induce vascularización y maduración de los organoides renales 18,19,20,21. Desafortunadamente, este es un proceso laborioso que no es adecuado para el análisis de un gran número de organoides.
Los embriones de pollo se han utilizado para estudiar la vascularización y el desarrollo durante más de un siglo22. Son de fácil acceso, requieren poco mantenimiento, carecen de un sistema inmunológico completamente funcional y pueden desarrollarse normalmente después de abrir la cáscara del huevo23,24,25,26. El trasplante de organoides en su membrana corioalantoidea (CAM) ha demostrado conducir a la vascularización27. Sin embargo, la duración del trasplante en el CAM, así como el nivel de maduración del injerto, están limitados por la formación de CAM, que tarda hasta el día 7 embrionario en completarse. Por lo tanto, recientemente se desarrolló un método para vascularizar eficientemente y madurar organoides renales a través del trasplante intracelómico en embriones de pollo28. La cavidad celómica de los embriones de pollo ha sido conocida desde la década de 1930 por ser un ambiente favorable para la diferenciación de tejidos embrionarios29,30. Se puede acceder a él temprano en el desarrollo embrionario y permite una expansión relativamente ilimitada del injerto en todas las direcciones.
Este documento describe un protocolo para el trasplante de organoides renales derivados de hiPSC en la cavidad celómica de embriones de pollo del día 4. Este método induce la vascularización y la maduración mejorada de los organoides en 8 días. La inyección de aglutinina culinaris (LCA) de lente marcada con fluorescencia antes de sacrificar los embriones permite la visualización de los vasos sanguíneos perfundidos dentro de los organoides a través de microscopía confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, se demuestra un protocolo para el trasplante intracelomico de organoides renales derivados de hiPSC en embriones de pollo. Tras el trasplante, los organoides son vascularizados por vasos sanguíneos perfundidos que consisten en una combinación de CE derivadas de organoides humanos y derivados de pollos. Estos se extienden por todo el organoide e invaden las estructuras glomerulares, permitiendo la interacción entre los CE y los podocitos. Anteriormente se demostró que esto conduce a una mayor madur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a George Galaris (LUMC, Leiden, Países Bajos) por su ayuda con la inyección de embriones de pollo. Reconocemos el apoyo de Saskia van der Wal-Maas (Departamento de Anatomía y Embriología, LUMC, Leiden, Países Bajos), Conny van Munsteren (Departamento de Anatomía y Embriología, LUMC, Leiden, Países Bajos), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Países Bajos) y Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Países Bajos). M. Koning cuenta con el apoyo de «Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC». Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo de la Universidad de Leiden “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund” GWF2019-02. Este trabajo cuenta con el apoyo de los socios de Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) y Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg y T.J. Rabelink cuentan con el apoyo del Centro de Medicina de Células Madre de la Fundación Novo Nordisk (reNEW), el Centro de Medicina con Células Madre de la Fundación Novo Nordisk cuenta con el apoyo de subvenciones de la Fundación Novo Nordisk (NNF21CC0073729).
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
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