Эффективная васкуляризация органоидов почек путем интраселомной трансплантации куриным эмбрионам
Summary
Здесь мы представляем подробный протокол трансплантации органоидов почек в поломическую полость куриных эмбрионов. Этот метод индуцирует васкуляризацию и ускоренное созревание органоидов в течение 8 дней и может быть использован для эффективного изучения этих процессов.
Abstract
Органоиды почек, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, содержат нефроноподобные структуры, которые в определенной степени напоминают таковые во взрослой почке. К сожалению, их клиническая применимость затруднена отсутствием функциональной сосудистой сети и, следовательно, ограниченным созреванием in vitro. Трансплантация органоидов почек в хеломическую полость куриных эмбрионов индуцирует васкуляризацию перфузированными кровеносными сосудами, в том числе образование клубочковых капилляров, и усиливает их созревание. Этот метод очень эффективен, позволяя проводить трансплантацию и анализ большого количества органоидов. В этой статье описывается подробный протокол интрацеломической трансплантации органоидов почек у куриных эмбрионов с последующей инъекцией флуоресцентно меченного лектина для окрашивания перфузированной сосудистой сети и сбора трансплантированных органоидов для анализа изображений. Этот метод может быть использован для индукции и изучения васкуляризации и созревания органоидов, чтобы найти ключи к усилению этих процессов in vitro и улучшить моделирование заболеваний.
Introduction
Было показано, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (hiPSC), полученные из органоидов почек, обладают потенциалом для исследований развития 1,2,3,4, скрининга токсичности 5,6 и моделирования заболеваний5,7,8,9,10,11,12,13. Однако их применимость для этих и возможных клинических целей трансплантации ограничена отсутствием сосудистой сети. Во время эмбрионального развития почек подоциты, мезангиальные клетки и эндотелиальные клетки сосудов (ЭК) взаимодействуют, образуя сложную структуру клубочка. Без этого взаимодействия клубочковый фильтрационный барьер, состоящий из подоцитов, клубочковой базальной мембраны (GBM) и ECs, не может нормально развиваться14,15,16. Хотя органоиды почек in vitro содержат некоторые ЭК, они не образуют надлежащую сосудистую сеть и со временемуменьшаются 17. Поэтому неудивительно, что органоиды остаются незрелыми. Трансплантация мышам индуцирует васкуляризацию и созревание органоидов почек 18,19,20,21. К сожалению, это трудоемкий процесс, который не подходит для анализа большого количества органоидов.
Куриные эмбрионы используются для изучения васкуляризации и развития уже болеевека 22. Они легко доступны, требуют минимального ухода, не имеют полностью функциональной иммунной системы и могут нормально развиваться после вскрытия яичной скорлупы23,24,25,26. Было показано, что трансплантация органоидов на их хориоаллантоисную мембрану (CAM) приводит к васкуляризации27. Однако продолжительность трансплантации на CAM, а также уровень созревания трансплантата ограничены образованием CAM, которое завершается до 7-го эмбрионального дня. Поэтому недавно был разработан метод эффективной васкуляризации и созревания органоидов почек посредством интрасиломической трансплантации куриным эмбрионам28. С 1930-х годов известно, что целомическая полость куриных эмбрионов является благоприятной средой для дифференцировки эмбриональных тканей29,30. Он может быть доступен на ранних стадиях эмбрионального развития и позволяет относительно неограниченно расширять трансплантат во всех направлениях.
В этой статье изложен протокол трансплантации органоидов почек, полученных из hiPSC, в поломическую полость куриных эмбрионов 4-го дня. Этот метод индуцирует васкуляризацию и усиленное созревание органоидов в течение 8 дней. Инъекция флуоресцентно меченного хрусталика culinaris agglutinin (LCA) перед принесением эмбрионов в жертву позволяет визуализировать перфузированные кровеносные сосуды в органоидах с помощью конфокальной микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи демонстрируется протокол интрасиломической трансплантации органоидов почек, полученных из hiPSC, у куриных эмбрионов. При трансплантации органоиды васкуляризируются перфузированными кровеносными сосудами, которые состоят из комбинации ЭК, полученных из органоидов чел…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джорджа Галариса (LUMC, Лейден, Нидерланды) за помощь с инъекцией куриных эмбрионов. Мы выражаем благодарность за поддержку Саскии ван дер Валь-Маас (Департамент анатомии и эмбриологии, LUMC, Лейден, Нидерланды), Конни ван Мюнстерен (Департамент анатомии и эмбриологии, LUMC, Лейден, Нидерланды), Манон Зуурмонд (LUMC, Лейден, Нидерланды) и Аннемари де Грааф (LUMC, Лейден, Нидерланды). М. Конинг поддерживается ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’. Эта работа была частично поддержана Фондом Лейденского университета «Фонд профессора Яапа де Граффа-Линглинга Виядханрмы» GWF2019-02. Эта работа поддерживается партнерами Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) и Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. К.В. ван ден Берг и Т.Д. Рабелинк поддерживаются Центром медицины стволовых клеток Фонда Ново Нордиск (reNEW), Центр медицины стволовых клеток Фонда Ново Нордиск поддерживается грантами Фонда Ново Нордиск (NNF21CC0073729).
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
References
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
- . ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).
