JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

تقنية ثلاثية الأبعاد لتصور التغيرات الهيكلية للميتوكوندريا في خلايا سرطان البنكرياس

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65290
, , , , , ,
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy,Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إعادة بناء cristae الميتوكوندريا لتحقيق التصوير 3D بدقة عالية ودقة عالية وإنتاجية عالية.

Abstract

إن فهم السمات الديناميكية للبنية الفائقة لعضية الخلية ، والتي ليست غنية بالمعلومات غير المعروفة فحسب ، بل متطورة أيضا من منظور ثلاثي الأبعاد (3D) ، أمر بالغ الأهمية للدراسات الميكانيكية. يوفر المجهر الإلكتروني (EM) عمق تصوير جيد ويسمح بإعادة بناء مكدسات الصور عالية الدقة للتحقيق في التشكل الفائق للعضيات الخلوية حتى على مقياس النانومتر. لذلك ، تكتسب إعادة الإعمار 3D أهمية بسبب مزاياها التي لا تضاهى. يوفر المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) تقنية الحصول على الصور عالية الإنتاجية التي تسمح بإعادة بناء الهياكل الكبيرة في 3D من نفس المنطقة ذات الاهتمام في شرائح متتالية. لذلك ، أصبح تطبيق SEM في إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع لاستعادة البنية التحتية ثلاثية الأبعاد الحقيقية للعضيات شائعا بشكل متزايد. في هذا البروتوكول ، نقترح مزيجا من المقطع التسلسلي فائق النحافة وتقنيات إعادة البناء 3D لدراسة cristae الميتوكوندريا في خلايا سرطان البنكرياس. يتم وصف تفاصيل كيفية تنفيذ هذه التقنيات في هذا البروتوكول بطريقة خطوة بخطوة ، بما في ذلك طريقة الأوزميوم – ثيوكربوهيدرازيد – الأوزميوم (OTO) ، والتصوير التسلسلي للمقطع فائق النحافة ، وعرض التصور.

Introduction

الميتوكوندريا هي واحدة من أهم العضيات في الخلية. إنها بمثابة المحور المركزي للطاقة الحيوية الخلوية والتمثيل الغذائي 1,2 وتلعب دورا مهما في السرطان3. سرطان البنكرياس (PC) هو واحد من أصعب أنواع السرطان4 لعلاج بسبب انتشاره السريع وارتفاع معدل الوفيات. تم ربط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا ، والذي يحدث بشكل رئيسي بسبب التغيرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا3،5،6،7 ، بآليات المرض الكامنة وراء PC8. الميتوكوندريا هي أيضا ديناميكية للغاية ، وهو ما ينعكس في التغييرات المتكررة والديناميكية في اتصال الشبكة وهيكل cristae9. يمكن أن تؤثر إعادة تشكيل بنية cristae بشكل مباشر على وظيفة الميتوكوندريا والحالة الخلوية 10,11 ، والتي تتغير بشكل كبير أثناء نمو الخلايا السرطانية ، ورم خبيث ، وتغيرات البيئة الدقيقة للورم 12,13.

في السنوات الأخيرة ، درس العلماء هذه العضية باستخدام مراقبة EM14،15،16،17 ؛ على سبيل المثال ، قام الباحثون بتحليل ديناميكيات الميتوكوندريا باستخدام تقنيات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد6،7،18،19. تم تأسيس المفهوم العام وطريقة إعادة بناء 3D لصور المجهر الإلكتروني رسميا في وقت مبكر من 196820 وتضمنت الجمع بين المجهر الإلكتروني وحيود الإلكترون ومعالجة صور الكمبيوتر لإعادة بناء ذيل العاثية T4. حتى الآن ، حققت تقنية التصوير المجهري الإلكتروني 3D تقدما كبيرا من حيث دقة الصورة 21 ، ودرجة الأتمتة22 ، وحجم المعالجة23 ، وقد تم استخدامها على نطاق واسع بشكل متزايد في البحوث البيولوجية ، من مستوى الأنسجة إلى مستوى البنية التحتية للعضيات على مقياسنانومتر 24. في السنوات الأخيرة ، أصبح التصوير المجهري الإلكتروني 3D أيضا تقنية واعدة لمجموعة واسعة من التطبيقات25،26،27.

يوضح الاهتمام المتزايد بكريستا الميتوكوندريا بشكل خاص المتطلبات الأساسية لتصوير حجم البنية الفائقة. تم استخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لتصور العينات التي تم جمعها على شبكة نحاسية (400 شبكة)28 ، مع مرور حزمة الإلكترون عبر القسم. ومع ذلك ، نظرا للنطاق المحدود للشبكة النحاسية ، من المستحيل تصوير شرائح مستمرة من نفس العينة29 بشكل كامل. هذا يعقد دراسة الهياكل المستهدفة أثناء التصوير TEM. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد TEM على المهام اليدوية المستهلكة للوقت والمعرضة للخطأ ، بما في ذلك قص وجمع شرائح متعددة وتصويرها بالتتابع21 ، لذلك لا يتم تكييفه لإعادة بناء البنية التحتية للعينات كبيرةالحجم 23. في الوقت الحاضر ، يتم تحقيق إعادة بناء عالية الدقة لتصوير العينات كبيرة الحجم من خلال استخدام معدات متخصصة ، مثل صفيف كاميرا TEM (TEMCA) 30 أو نظامين من الجيل الثاني من TEMCA (TEMCA2) 31 ، مما يتيح التصوير الآلي عالي الإنتاجية في وقت قصير. ومع ذلك ، لا يتمتع هذا النوع من التصوير بسهولة الحصول عليه وعالمي بسبب متطلبات المعدات المخصصة.

بالمقارنة مع TEM ، فإن طريقة إنشاء الآلاف من الصور الحجمية التسلسلية تلقائيا لمناطق كبيرة استنادا إلى SEM 32,33 تعزز كفاءة وموثوقية التصوير التسلسلي وتوفر دقة z أعلى34. على سبيل المثال ، أتاح كل من المجهر الإلكتروني الماسح التسلسلي للوجه (SBF-SEM) والمجهر الإلكتروني الماسح الأيوني المركز (FIB-SEM) تحقيق إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للبنية التحتية بسرعة عالية وكفاءة ودقة35,36. ومع ذلك ، فمن المحتم أن يتم حلق سطح الكتلة ميكانيكيا بواسطة سكين الماس في SBF-SEM أو عن طريق الطحن باستخدام الحزمة الأيونية المركزة ل FIB-SEM33,37. نظرا لتدمير الطريقتين للعينات ، لا يمكن إعادة بناء نفس الهيكل المستهدف مرة أخرى لمزيد من التحليل38،39،40. بالإضافة إلى ذلك ، حاولت دراسات قليلة إعادة بناء البنية التحتية للعضيات ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية باستخدام EM لمراقبة التغيرات المرضية12. لهذه الأسباب ، من أجل زيادة توضيح الآليات المرضية للخلايا السرطانية ، مثل خلايا سرطان البنكرياس ، نقترح تقنية جديدة لإعادة بناء 3D لصور المقطع التسلسلي باستخدام المجهر الفائق والمجهر الإلكتروني الماسح للانبعاثات الميدانية (FE-SEM) لتحليل البنية التحتية للميتوكوندريا على مستوى cristae ؛ باستخدام هذه التقنية ، يمكن الحصول على بيانات عالية الدقة باستخدام طريقة فعالة ويمكن الوصول إليها. يمكن تخزين المقاطع التسلسلية فائقة النحافة المصنوعة باستخدام ultramicrotome بشكل شبه دائم في علبة شبكية وإعادة تصويرها عدة مرات ، حتى بعد عدة سنوات41. تحظى FE-SEM بتقدير كبير كأداة في مختلف المجالات البحثية نظرا لقدرتها على توفير تصوير عالي الدقة وتكبير عالي وتعدد الاستخدامات42. في محاولة لعرض البنية الدقيقة للعضيات في 3D ، يمكن أيضا استخدام تقنية إنتاج مكدسات صور 2D التسلسلية بدقة مفيدة باستخدام الإلكترونات المبعثرة الخلفية التي تنتجها FE-SEM 43,44 لتحقيق تصوير عالي الإنتاجية ومتعدد المقاييس للمناطق المستهدفة أو الهياكل المرتبطة بها بدون معدات خاصة 45. يؤثر إنشاء القطع الأثرية المشحونة بشكل مباشر على جودة الصور التي تم الحصول عليها ، لذلك من المهم بشكل خاص الحفاظ على وقت المكوث قصيرا.

وهكذا ، توضح الدراسة الحالية الإجراءات التجريبية المستخدمة في تقنية SEM هذه لإعادة بناء بنية 3D لكريستي الميتوكوندريا46. على وجه التحديد ، نعرض العملية التي تم تطويرها لتحقيق التجزئة شبه التلقائية لمناطق الميتوكوندريا ورقمنة إعادة الإعمار 3D باستخدام برنامج Amira ، والذي يتضمن أيضا عمل عينات شرائح باستخدام طريقة تحضير عينة OTO التقليدية44,47 ، واستكمال مجموعة الأقسام باستخدام تشريح ultramicrotome ، والحصول على بيانات 2D متسلسلة بواسطة FE-SEM.

Protocol

1. إعداد المواد مزرعة 2 × 106 خلايا Panc02 في 12 مل من وسط DMEM (10٪ مصل بقري جنيني و 100 وحدة / مل من البنسلين والستربتومايسين) ، والحفاظ على 37 درجة مئوية ورطوبة 95٪ في جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ هواء لمدة 48 ساعة. جمع خلايا Panc02 ، وأجهزة الطرد المركزي في 28 × غرام لمدة 2 دقي?…

Representative Results

أثناء زراعة الخلايا (الشكل 1 أ) ، قمنا أولا بتقسيم خلايا سرطان البنكرياس إلى مجموعة تحكم مستزرعة بوسط زراعة كامل ، ومجموعة (1S ، 3R) -RSL348 (RSL3 ، منشط فيروبتوسيس ، 100 نانومتر) ، ومجموعة RSL3 (100 نانومتر) بالإضافة إلى فيروستاتين -149 (Fer-1 ، مثبط داء الحديديات ، 100 …

Discussion

الطريقة المعروضة هنا هي دليل مفيد خطوة بخطوة لتطبيق تقنية إعادة الإعمار 3D ، والتي تتضمن تطبيق المجهر الإلكتروني وتكنولوجيا معالجة الصور على تكديس وتجزئة الصور المقطعية 2D المتولدة من المقاطع التسلسلية فائقة النحافة. يسلط هذا البروتوكول الضوء على قيود على صور 2D التي يمكن معالجتها من خلال ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من خلال منح مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ (Z23H290001 ، LY19H280001) ؛ منح المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82274364 و 81673607 و 81774011) ؛ بالإضافة إلى مشروع أبحاث الرفاهية العامة لمنحة هوتشو للعلوم والتكنولوجيا (2021GY49 ، 2018GZ24). نحن نقدر المساعدة الكبيرة والدعم الفني والدعم التجريبي من المنصة العامة لمركز البحوث الطبية ، أكاديمية العلوم الطبية الصينية ، جامعة تشجيانغ الطبية الصينية.

Materials

(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929 2020.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
  3. Dias, N., Bailly, C. Drugs targeting mitochondrial functions to control tumor cell growth. Biochemical Pharmacology. 70 (1), 1-12 (2005).
  4. Toshiyama, R., et al. Two cases of resectable pancreatic cancer diagnosed by open surgical biopsy after endoscopic ultrasound fine-needle aspiration failed to yield diagnosis: Case reports. Surgical Case Reports. 3 (1), 39 (2017).
  5. Hoffmann, M., et al. elegans ATAD-3 is essential for mitochondrial activity and development. PLoS One. 4 (10), e7644 (2009).
  6. Vincent, A. E., et al. The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondrial myopathy. Scientific Reports. 6, 30610 (2016).
  7. Strubbe-Rivera, J. O., et al. The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-EM reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function. Scientific Reports. 11 (1), 1037 (2021).
  8. Nagdas, S., et al. Drp1 promotes KRas-driven metabolic changes to drive pancreatic tumor growth. Cell Reports. 28 (7), 1845-1859 (2019).
  9. Sukhorukov, V. M., Bereiter-Hahn, J. Anomalous diffusion induced by cristae geometry in the inner mitochondrial membrane. PLoS One. 4 (2), e4604 (2009).
  10. Cogliati, S., et al. Mitochondrial cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
  11. Shi, P., et al. Mechanical instability generated by myosin 19 contributes to mitochondria cristae architecture and OXPHOS. Nature Communications. 13 (1), 2673 (2022).
  12. Moscheni, C., et al. 3D quantitative and ultrastructural analysis of mitochondria in a model of doxorubicin sensitive and resistant human colon carcinoma cells. Cancers. 11 (9), 1254 (2019).
  13. Porporato, P. E., Filigheddu, N., Pedro, J. M. B., Kroemer, G., Galluzzi, L. Mitochondrial metabolism and cancer. Cell Research. 28 (3), 265-280 (2018).
  14. Sachse, M., Fernández de Castro, I., Tenorio, R., Risco, C. The viral replication organelles within cells studied by electron microscopy. Advances in Virus Research. 105, 1-33 (2019).
  15. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3D architecture using FIB-SEM. Microscopy. 70 (2), 161-170 (2021).
  16. Wischnitzer, S. An electron microscope study of cytoplasmic organelle transformations in developing mouse oocytes. Wilhelm Roux’ Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (2), 150-172 (1970).
  17. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. Journal of Microscopy. 259 (2), 155-164 (2015).
  18. Mourier, A., Ruzzenente, B., Brandt, T., Kühlbrandt, W., Larsson, N. G. Loss of LRPPRC causes ATP synthase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (10), 2580-2592 (2014).
  19. Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8 (1), 350 (2018).
  20. Cremers, A. F., Schepman, A. M., Visser, M. P., Mellema, J. E. An analysis of the contracted sheath structure of bacteriophage Mu. European Journal of Biochemistry. 80 (2), 393-400 (1977).
  21. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Frontiers in Neural Circuits. 12, 98 (2018).
  23. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172 (2012).
  24. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
  25. Kittelmann, M. 3D electron microscopy of the ER. Methods in Molecular Biology. 1691, 15-21 (2018).
  26. Müller-Reichert, T., Kiewisz, R., Redemann, S. Mitotic spindles revisited – New insights from 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 131 (3), 211383 (2018).
  27. Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  28. Geys, J., et al. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: Impact of surface charge. Environmental Health Perspectives. 116 (12), 1607-1613 (2008).
  29. Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
  30. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  31. Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
  32. Zechmann, B., Möstl, S., Zellnig, G. Volumetric 3D reconstruction of plant leaf cells using SEM, ion milling, TEM, and serial sectioning. Planta. 255 (6), 118 (2022).
  33. Laws, R., Steel, D. H., Rajan, N. Research techniques made simple: Volume scanning electron microscopy. The Journal of Investigative Dermatology. 142 (2), 265-271 (2022).
  34. Lippens, S., Kremer, A., Borghgraef, P., Guérin, C. J. Serial block face-scanning electron microscopy for volume electron microscopy. Methods in Cell Biology. 152, 69-85 (2019).
  35. Schneider, J. P., Hegermann, J., Wrede, C. Volume electron microscopy: Analyzing the lung. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 241-260 (2021).
  36. Lewis, P. N., Young, R. D., Souza, R. B., Quantock, A. J., Meek, K. M. Contrast-enhanced tissue processing of fibrillin-rich elastic fibres for 3D visualization by volume scanning electron microscopy. Methods and Protocols. 4 (3), 56 (2021).
  37. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 154-161 (2012).
  38. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  39. Wacker, I., et al. Hierarchical imaging: A new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biology. 17 (1), 38 (2016).
  40. Koga, D., Kusumi, S., Shibata, M., Watanabe, T. Applications of scanning electron microscopy using secondary and backscattered electron signals in neural structure. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 759804 (2021).
  41. Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 627368 (2021).
  42. Suga, M., et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials. Progress in Solid State Chemistry. 42 (1-2), 1-21 (2014).
  43. Koga, D., Ushiki, T., Watanabe, T. Novel scanning electron microscopy methods for analyzing the 3D structure of the Golgi apparatus. Anatomical Science International. 92 (1), 37-49 (2017).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Koga, D., Kusumi, S., Ushiki, T. Three-dimensional shape of the Golgi apparatus in different cell types: serial section scanning electron microscopy of the osmium-impregnated Golgi apparatus. Microscopy. 65 (2), 145-157 (2016).
  46. Son, R., et al. Morphomics via next-generation electron microscopy. arXiv. 2111, 14373 (2021).
  47. Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390 (2021).
  48. Shin, D., Kim, E. H., Lee, J., Roh, J. L. Nrf2 inhibition reverses resistance to GPX4 inhibitor-induced ferroptosis in head and neck cancer. Free Radical Biology & Medicine. 129, 454-462 (2018).
  49. Skouta, R., et al. Ferrostatins inhibit oxidative lipid damage and cell death in diverse disease models. Journal of the American Chemical Society. 136 (12), 4551-4556 (2014).
  50. Heinen-Weiler, J., et al. Superiority of focused ion beam-scanning electron microscope tomography of cardiomyocytes over standard 2D analyses highlighted by unmasking mitochondrial heterogeneity. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (4), 933-954 (2021).
  51. Randles, M. J., et al. Three-dimensional electron microscopy reveals the evolution of glomerular barrier injury. Scientific Reports. 6, 35068 (2016).
  52. Vincent, A. E., et al. Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network. Cell Reports. 27 (1), 321 (2019).
  53. Oh, S. J., Ikeda, M., Ide, T., Hur, K. Y., Lee, M. S. Mitochondrial event as an ultimate step in ferroptosis. Cell Death Discovery. 8 (1), 414 (2022).
  54. Jang, S., et al. Elucidating the contribution of mitochondrial glutathione to ferroptosis in cardiomyocytes. Redox Biology. 45, 102021 (2021).
  55. Sui, X., et al. RSL3 Drives ferroptosis through GPX4 inactivation and ROS production in colorectal cancer. Frontiers in Pharmacology. 9, 1371 (2018).
  56. Jelinek, A., et al. Mitochondrial rescue prevents glutathione peroxidase-dependent ferroptosis. Free Radical Biology & Medicine. 117, 45-57 (2018).
  57. Rennie, M. Y., Gahan, C. G., López, C. S., Thornburg, K. L., Rugonyi, S. 3D imaging of the early embryonic chicken heart with focused ion beam scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1111-1119 (2014).
  58. Garza-Lopez, E., et al. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65 (2021).
  59. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
  60. Thomas, C. I., et al. Targeting functionally characterized synaptic architecture using inherent fiducials and 3D correlative microscopy. Microscopy and Microanalysis. 27 (1), 156-169 (2021).
  61. Friedman, P. L., Ellisman, M. H. Enhanced visualization of peripheral nerve and sensory receptors in the scanning electron microscope using cryofracture and osmium-thiocarbohydrazide-osmium impregnation. Journal of Neurocytology. 10 (1), 111-131 (1981).
  62. Oho, E., Suzuki, K., Yamazaki, S. Applying fast scanning method coupled with digital image processing technology as standard acquisition mode for scanning electron microscopy. Scanning. 2020, 4979431 (2020).
  63. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).
  64. Trebichalská, Z., et al. High-resolution 3D reconstruction of human oocytes using focused ion beam scanning electron microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 755740 (2021).
  65. Wei, D., et al. High-resolution three-dimensional reconstruction of a whole yeast cell using focused-ion beam scanning electron microscopy. BioTechniques. 53 (1), 41-48 (2012).
  66. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. eLife. 6, 25916 (2017).
  67. Zhu, T., et al. Live cell mitochondrial 3-dimensional dynamic ultrastructures under oxidative phosphorylation revealed by a Pyridine-BODIPY probe. Biosensors & Bioelectronics. 178, 113036 (2021).
  68. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11 (1), 3699 (2020).
  69. Vicidomini, G., Bianchini, P., Diaspro, A. STED super-resolved microscopy. Nature Methods. 15 (3), 173-182 (2018).
  70. Theurey, P., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 129-143 (2016).
  71. Stoica, R., et al. ER-mitochondria associations are regulated by the VAPB-PTPIP51 interaction and are disrupted by ALS/FTD-associated TDP-43. Nature Communications. 5, 3996 (2014).
  72. Bruno, S. R., Anathy, V. Lung epithelial endoplasmic reticulum and mitochondrial 3D ultrastructure: a new frontier in lung diseases. Histochemistry and Cell Biology. 155 (2), 291-300 (2021).
  73. Park, S. J., Schertel, A., Lee, K. E., Han, S. S. Ultra-structural analysis of the brain in a Drosophila model of Alzheimer’s disease using FIB/SEM microscopy. Microscopy. 63 (1), 3-13 (2014).
  74. Torkamani, N., et al. Three dimensional glomerular reconstruction: A novel approach to evaluate renal microanatomy in diabetic kidney disease. Scientific Reports. 9 (1), 1829 (2019).

Tags

3D ReconstructionElectron MicroscopyUltrastructureMitochondriaPancreatic CancerOrganelle MorphologyOTO MethodSerial SectioningVisualization
check_url/it/65290?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image