Этот протокол описывает, как реконструировать митохондриальные кристы для получения 3D-визуализации с высокой точностью, высоким разрешением и высокой пропускной способностью.
Понимание динамических особенностей ультраструктуры клеточных органелл, которая не только богата неизвестной информацией, но и сложна с трехмерной (3D) точки зрения, имеет решающее значение для механистических исследований. Электронная микроскопия (ЭМ) обеспечивает хорошую глубину изображения и позволяет реконструировать стеки изображений с высоким разрешением для исследования ультраструктурной морфологии клеточных органелл даже в нанометровом масштабе; Поэтому 3D-реконструкция приобретает все большее значение благодаря своим несравненным преимуществам. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) представляет собой высокопроизводительную технологию получения изображений, которая позволяет реконструировать большие структуры в 3D из одной и той же интересующей области на последовательных срезах. Поэтому применение СЭМ в крупномасштабной 3D-реконструкции для восстановления истинной 3D-ультраструктуры органелл становится все более распространенным. В этом протоколе мы предлагаем комбинацию серийных ультратонких срезов и методов 3D-реконструкции для изучения митохондриальных крист в клетках рака поджелудочной железы. Подробная информация о том, как выполняются эти методы, описана в этом протоколе пошагово, включая метод осмий-тиокарбогидразид-осмий (OTO), последовательную визуализацию ультратонких срезов и дисплей визуализации.
Митохондрии являются одними из самых важных органелл в клетке. Они служат центральным узлом клеточной биоэнергетики и метаболизма 1,2 и играют важнейшую роль в развитии рака3. Рак поджелудочной железы (РПЖ) является одним из самых трудно поддающихся лечению онкологических заболеванийиз-за его быстрого распространения и высокого уровня смертности. Митохондриальная дисфункция, которая в основном вызвана изменениями в морфологии митохондрий 3,5,6,7, связана с механизмами заболевания, лежащими в основе ПК8. Митохондрии также очень динамичны, что отражается в частых и динамичных изменениях в их сетевой связности и структуре крист9. Изменение структуры крист может непосредственно влиять на функцию митохондрий и клеточное состояние 10,11, которые значительно изменяются во время роста опухолевых клеток, метастазирования и изменений микроокружения опухоли 12,13.
В последние годы ученые изучали эту органеллу с помощью ЭМ-наблюдений14,15,16,17; Например, исследователи проанализировали динамику митохондрий с помощью методов 3D-реконструкции 6,7,18,19. Общая концепция и метод 3D-реконструкции изображений электронной микроскопии были официально установлены еще в 1968 году и включали в себя сочетание электронной микроскопии, электронной дифракциии компьютерной обработки изображений для реконструкции фагового хвоста Т4. До настоящего времени технология 3D-визуализации электронной микроскопии добилась значительных успехов с точки зрения разрешения изображения 21, степени автоматизации22 и объема обработки23 и использовалась во все более широком масштабе в биологических исследованиях, от уровня тканей до уровня ультраструктуры органелл в нанометровом масштабе24. В последние годы 3D-визуализация в электронной микроскопии также стала перспективной технологией для широкого спектра применений25,26,27.
Растущее внимание к митохондриальным кристам особенно иллюстрирует основные требования к визуализации ультраструктурного объема. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) была использована для визуализации образцов, собранных на медной сетке (400 меш)28, при этом электронный пучок проходит через разрез. Однако из-за ограниченного диапазона медной сетки невозможно полностью отобразить непрерывные срезы одного и того же образца29. Это усложняет изучение структур-мишеней при ПЭМ-визуализации. Кроме того, ПЭМ полагается на трудоемкие и подверженные ошибкам ручные задачи, включая вырезание и сбор нескольких срезов и их последовательную визуализацию21, поэтому он не приспособлен для ультраструктурных реконструкций образцов большого объема23. В настоящее время реконструкция изображений больших объемов образцов с высоким разрешением достигается за счет использования специализированного оборудования, такого как массив камер TEM (TEMCA)30 или две системы TEMCA второго поколения (TEMCA2)31, которые позволяют автоматизировать высокопроизводительную визуализацию за короткое время. Тем не менее, этот тип визуализации не имеет преимущества в том, что он прост в получении и универсален из-за необходимости индивидуального оборудования.
По сравнению с ПЭМ, метод автоматической генерации тысяч последовательных объемных изображений для больших площадей на основе SEM 32,33 повышает эффективность и надежность последовательной визуализации и обеспечивает более высокое z-разрешение34. Например, серийная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) и сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионным пучком (FIB-SEM) позволили достичь 3D-реконструкции ультраструктуры с высокой скоростью, эффективностью и разрешением35,36. Тем не менее, поверхность блока неизбежно срезается механическим способом алмазным ножом SBF-SEM или фрезерованием сфокусированным ионным пучком FIB-SEM33,37. Из-за деструктивного действия двух методов на образцы невозможно повторно реконструировать ту же структуру мишени для дальнейшего анализа38,39,40. Кроме того, в нескольких исследованиях была предпринята попытка реконструировать ультраструктуру 3D-органелл раковых клеток с помощью ЭМ для наблюдения за патологическими изменениями12. По этим причинам для дальнейшего выяснения патологических механизмов раковых клеток, таких как клетки рака поджелудочной железы, мы предлагаем новую технологию 3D-реконструкции изображений серийных срезов с использованием ультрамикротома и полевого эмиссионного сканирующего электронного микроскопа (FE-SEM) для анализа ультраструктуры митохондрий на уровне крист; С помощью этой технологии можно получать данные с высоким разрешением, используя эффективный и доступный метод. Серийные ультратонкие срезы, изготовленные с помощью ультрамикротома, могут храниться в сетчатом футляре и многократно повторяться, даже по прошествиинескольких лет. FE-SEM высоко ценится как инструмент в различных областях исследований благодаря своей способности обеспечивать получение изображений с высоким разрешением, большим увеличением и универсальностью42. В попытке отобразить тонкую структуру органелл в 3D, метод получения последовательных стеков 2D-изображений с полезным разрешением с использованием обратно рассеянных электронов, полученных с помощью FE-SEM 43,44, также может быть использован для достижения высокопроизводительной и многомасштабной визуализации целевых областей или связанных с ними структур без специального оборудования45. Генерация артефактов заряда напрямую влияет на качество получаемых изображений, поэтому особенно важно сократить время выдержки.
Таким образом, настоящее исследование развивает экспериментальные процедуры, используемые в этом методе SEM для реконструкции 3D-структуры митохондриальных крист46. В частности, мы показываем процесс, разработанный для достижения полуавтоматической сегментации митохондриальных областей и оцифровки 3D-реконструкции с помощью программного обеспечения Amira, который также включает в себя изготовление образцов срезов с использованием традиционного метода подготовки образцов OTO44,47, завершение сбора срезов с помощью ультрамикротомной резки и получение последовательных 2D-данных с помощью FE-SEM.
Представленный здесь метод представляет собой полезное пошаговое руководство по применению техники 3D-реконструкции, которая включает в себя применение технологии электронной микроскопии и обработки изображений для укладки и сегментации 2D-томографических изображений, полученных из…
The authors have nothing to disclose.
Исследование выполнено при поддержке грантов Фонда естественных наук провинции Чжэцзян (Z23H290001, LY19H280001); гранты Национального фонда естественных наук Китая (82274364, 81673607 и 81774011); а также Исследовательский проект общественного благосостояния Научно-технического гранта Хучжоу (2021GY49, 2018GZ24). Мы ценим большую помощь, техническую поддержку и экспериментальную поддержку со стороны Общественной платформы Медицинского исследовательского центра Академии китайских медицинских наук, Чжэцзянского китайского медицинского университета.
(1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
Acetone | SIGMA | 179124 | |
Amira | Visage Imaging | ||
Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 | 2020.2 |