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Ricerca sul cancro

膵臓癌細胞のミトコンドリアの微細構造変化を可視化する3次元技術

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/65290
, , , , , ,
1School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University, 2Department of Pharmacy,Zhejiang Provincial Dermatology Hospital, 3Academy of Chinese Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

Summary

このプロトコルは、ミトコンドリアクリステを再構築して、高精度、高解像度、および高スループットの3Dイメージングを実現する方法について説明します。

Abstract

未知の情報が豊富であるだけでなく、3次元(3D)の視点から洗練された細胞小器官の微細構造の動的特徴を理解することは、機構研究にとって重要です。電子顕微鏡(EM)は、優れたイメージング深度を提供し、高解像度の画像スタックの再構築を可能にして、ナノメートルスケールでも細胞小器官の微細構造形態を調査できます。したがって、3D再構築は、その比類のない利点のために重要性を増しています。走査型電子顕微鏡(SEM)は、連続したスライスの同じ関心領域から大きな構造を3Dで再構築できるハイスループット画像取得技術を提供します。したがって、細胞小器官の真の3D微細構造を復元するための大規模な3D再構成におけるSEMの適用はますます一般的になっています。このプロトコルでは、膵臓癌細胞のミトコンドリアクリステを研究するために、連続超薄切片と3D再構成技術の組み合わせを提案します。これらの技術がどのように実行されるかの詳細は、オスミウム-チオカルボヒドラジド-オスミウム(OTO)法、シリアル超薄切片イメージング、および視覚化表示を含む、このプロトコルで段階的に説明されています。

Introduction

ミトコンドリアは細胞内で最も重要な細胞小器官の1つです。それらは細胞の生体エネルギーと代謝の中心的なハブとして機能し1,2、癌において重要な役割を果たします3。膵臓がん(PC)は、その急速な広がりと高い死亡率のために、治療が最も困難ながんの1つです4。主にミトコンドリアの形態の変化によって引き起こされるミトコンドリア機能障害3,5,6,7は、PC8の根底にある疾患メカニズムに関連しています。ミトコンドリアも非常に動的であり、これはネットワーク接続とクリステ構造の頻繁かつ動的な変化に反映されています9。クリステ構造の再形成は、ミトコンドリア機能と細胞状態に直接影響を与える可能性があり10,11、腫瘍細胞の成長、転移、および腫瘍微小環境の変化中に著しく変化します12,13。

近年、科学者たちはEM観察14,15,16,17を用いてこの細胞小器官を研究しています。たとえば、研究者は3D再構成技術を使用してミトコンドリアのダイナミクスを分析しました6、7、18、19。電子顕微鏡画像の3D再構成の一般的な概念と方法は、早くも196820に正式に確立され、電子顕微鏡、電子回折、およびコンピューター画像処理を組み合わせてT4ファージテールを再構築することが含まれていました。これまで、電子顕微鏡3Dイメージング技術は、画像解像度21、自動化度22、処理量23の面で大きな進歩を遂げ、組織レベルからナノメートルスケールのオルガネラ微細構造レベル24まで、生物学研究においてますます幅広い規模で使用されてきました。近年、電子顕微鏡3Dイメージングも幅広い用途の有望な技術となっています25、26、27。

ミトコンドリアクリステへの注目の高まりは、特に微細構造体積イメージングの本質的な要件を示しています。透過型電子顕微鏡(TEM)は、銅グリッド(400メッシュ)28に集められたサンプルを視覚化するために使用され、電子ビームはセクションを通過します。しかしながら、銅グリッドの範囲が限られているため、同じサンプル29の連続スライスを完全に画像化することは不可能である。これは、TEMイメージング中の標的構造の研究を複雑にする。さらに、TEMは、複数のスライスの切断と収集、およびそれらを順次イメージングするなど、時間がかかり、エラーが発生しやすい手動タスクに依存しているため21、大量のサンプルの微細構造再構成には適していません23。現在、TEMカメラアレイ(TEMCA)30 や2台の第2世代TEMCAシステム(TEMCA2)31など、短時間でハイスループットなイメージングを自動化する専用装置を使用することで、大容量サンプルイメージングの高解像度再構成を実現しています。ただし、このタイプのイメージングには、カスタマイズされた機器が必要なため、入手が容易で普遍的であるという利点はありません。

TEMと比較して、SEM32、33に基づいて大面積の数千のシリアル体積画像を自動的に生成する方法は、シリアルイメージングの効率および信頼性を高め、より高いz解像度を提供する34。たとえば、シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBF-SEM)と集束イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)はどちらも、高速、効率、解像度で微細構造の3D再構成を実現することを可能にしました35,36。ただし、SBF-SEMのダイヤモンドナイフまたはFIB-SEM33,37の集束イオンビームによるフライス加工によって、ブロック表面が機械的に削り取られることは避けられません。試料に対する2つの方法の破壊性のために、さらなる分析のために同じ標的構造を再び再構築することは不可能である38、39、40。さらに、EMを使用して癌細胞の3Dオルガネラ微細構造を再構築し、病理学的変化を観察することを試みた研究はほとんどありません12。このような理由から、膵臓がん細胞などのがん細胞の病態メカニズムをさらに解明するために、ウルトラミクロトームと電界放出型走査電子顕微鏡(FE-SEM)を用いて、ミトコンドリアの微細構造をクリステレベルで解析する新しい断面像を3次元再構成する技術を提案する。この技術により、効率的でアクセスしやすい方法で高解像度のデータを取得できます。ウルトラミクロトームを使用して作られた連続超薄切片は、グリッドケースに半永久的に保管し、数年後でも複数回再イメージングすることができます41。FE-SEMは、高解像度のイメージング、高倍率、汎用性を提供できるため、さまざまな研究分野でツールとして高く評価されています42。オルガネラの微細構造を3Dで表示するために、FE-SEM 43,44によって生成された後方散乱電子を使用して有用な解像度でシリアル2D画像スタックを生成する技術を使用して、特別な装置なしでターゲット領域またはそれらに関連する構造のハイスループットおよびマルチスケールイメージングを達成することもできます45.電荷アーチファクトの生成は、取得した画像の品質に直接影響するため、滞留時間を短くすることが特に重要です。

したがって、本研究では、ミトコンドリアクリステ46の3D構造を再構築するためにこのSEM技術で採用された実験手順について詳しく説明します。具体的には、従来のOTO標本作製法44,47を用いたスライスサンプルの作成、ウルトラミクロトームスライスによる切片採取の完了、FE-SEMによる逐次2Dデータの取得など、Amiraソフトウェアを用いたミトコンドリア領域の半自動セグメンテーションと3D再構成のデジタル化を実現するためのプロセスを紹介します。

Protocol

1.材料の準備 12 mLのDMEM培地(10%ウシ胎児血清および100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン)で2 x 106 Panc02細胞を培養し、5%二酸化炭素および95%空気の雰囲気下で37°Cおよび95%湿度で48時間維持します。 Panc02細胞を回収し、28 x g で2分間遠心分離した後、上清を廃棄します。サンプルが適切なサイズ(1 x 107 セル)であることを確認してください、そう…

Representative Results

細胞培養(図1A)では、まず膵臓がん細胞を完全培養液で培養した対照群、(1S,3R)-RSL348(RSL3、フェロトーシス活性化因子、100nM)群、およびRSL3(100nM)プラスフェロスタチン-149(Fer-1、フェロトーシス阻害剤、100nM)群に分けました。以上の実験ステップにより、走査型電子顕微鏡により、対照群、RSL3群、阻害剤群(RSL3+Fer-1群)について、それぞれ3…

Discussion

ここで紹介する方法は、連続した超薄膜切片から生成された2D断層画像の積層とセグメンテーションに電子顕微鏡と画像処理技術を適用することを含む3D再構成技術を適用するための有用なステップバイステップガイドです。このプロトコルは、高解像度レベルでの構造の強力な再現性とより高い精度の利点を持つオルガネラ微細構造の3D視覚化によって対処できる2D画像の限界を強調してい?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、浙江省自然科学財団の助成金(Z23H290001、LY19H280001)の支援を受けました。中国国家自然科学財団の助成金(82274364、81673607、および81774011);湖州科学技術助成金の公共福祉研究プロジェクト(2021GY49、2018GZ24)。浙江省中国医科大学中国医学アカデミー医学研究センターのパブリックプラットフォームからの多大な支援、技術サポート、実験的サポートに感謝します。

Materials

(1S,3R)-RSL3 MCE HY-100218A
Acetone SIGMA 179124
Amira Visage Imaging
Aspartic acid MCE HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco 11995115
Ethanol Merck 100983
Ferrostatin-1 MCE HY-100579
Fetal bovine serum Gibco 10437010
Field emission scanning electron microscope HITACHI SU8010
Glutaraldehyde Alfa Aesar A10500.22
Lead nitrate SANTA CRUZ sc-211724
Osmium Tetroxide SANTA CRUZ sc-206008B
Panc02 European Collection of Authenticated Cell Cultures  98102213
Penicillin-streptomycin Biosharp BL505A
Phosphate Buffered Saline Biosharp BL302A
Pon 812 Epoxy resin SPI CHEM GS02660
Potassium ferrocyanide Macklin P816416
Thiocarbohydrazide Merck 223220
Ultramicrotome LEICA EMUC7
Uranyl Acetate RHAWN R032929 2020.2
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Qi, Y., Liu, Y., Huang, Y., Xiong, M., You, S., Wang, B., Gu, M. A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65290, doi:10.3791/65290 (2023).
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