Un framework open-source pour le calcul de la masse de molécules thérapeutiques à base d’anticorps

Summary

Cet article décrit l’utilisation d’une application logicielle, mAbScale, pour le calcul des masses pour les protéines thérapeutiques à base d’anticorps monoclonaux.

Abstract

Les masses biothérapeutiques sont un moyen de vérifier l’identité et l’intégrité structurelle. La spectrométrie de masse (MS) de protéines intactes ou de sous-unités protéiques fournit un outil d’analyse facile pour les différentes étapes du développement biopharmaceutique. L’identité de la protéine est confirmée lorsque la masse expérimentale de la MS se situe dans une plage d’erreur de masse prédéfinie par rapport à la masse théorique. Bien qu’il existe plusieurs outils informatiques pour le calcul des poids moléculaires des protéines et des peptides, ils n’ont pas été conçus pour une application directe aux entités biothérapeutiques, ont des limitations d’accès en raison de licences payantes ou nécessitent le téléchargement de séquences protéiques sur des serveurs hôtes.

Nous avons développé une routine modulaire de calcul de masse qui permet de déterminer facilement les masses moyennes ou monoisotopiques et les compositions élémentaires des glycoprotéines thérapeutiques, y compris les anticorps monoclonaux (mAb), les anticorps bispécifiques (bsAb) et les conjugués anticorps-médicament (ADC). La nature modulaire de ce cadre de calcul basé sur Python permettra d’étendre cette plate-forme à d’autres modalités telles que les vaccins, les protéines de fusion et les oligonucléotides à l’avenir, et ce cadre pourrait également être utile pour l’interrogation des données de spectrométrie de masse descendantes. En créant une application de bureau autonome open source avec une interface utilisateur graphique (GUI), nous espérons surmonter les restrictions liées à l’utilisation dans des environnements où les informations propriétaires ne peuvent pas être téléchargées sur des outils Web. Cet article décrit les algorithmes et l’application de cet outil, mAbScale, à différentes modalités thérapeutiques à base d’anticorps.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, les produits biothérapeutiques ont évolué pour devenir un pilier de l’industrie pharmaceutique moderne. La pandémie de SRAS-CoV2 et d’autres maladies potentiellement mortelles ont encore accru la nécessité d’un développement plus rapide et plus large de molécules biopharmaceutiques ^1,2,3.

Le poids moléculaire biothérapeutique est critique pour l’identification de la molécule, en combinaison avec d’autres tests analytiques. Les masses de sous-unités intactes et réduites sont utilisées tout au long des cycles de vie de découverte et de développement dans le cadre de stratégies de contrôle visant à maintenir la qualité, comme décrit dans le QTPP (Quality Target Product Profile)⁴.

Le développement analytique dans l’industrie biopharmaceutique repose fortement sur les mesures de masse pour l’analyse de la masse intacte et la caractérisation en profondeur à l’aide de la cartographie peptidique ou de la surveillance par méthode multi-attributs (MAM). Au centre de ces techniques utilisant des plates-formes modernes de spectrométrie de masse (MS) se trouve la capacité de fournir des mesures de masse précises à haute résolution (HR/AM). La plupart des instruments HR/AM offrent des précisions de masse comprises entre 0,5 et 5 ppm, qui s’adaptent à la plage de masse. La capacité de mesurer avec précision les masses de grosses molécules intactes permet d’identifier rapidement et en toute confiance les produits thérapeutiques à grandes molécules. Comme la résolution isotopique ne peut pas être atteinte dans des conditions expérimentales typiques pour les grosses molécules (>10 kDa), les masses moyennes doivent être calculées pour la comparaison et l’identification ^5,6.

Un spectre de masse protéique intact ou sous-unitaire typique représente le profil protéoforme global, qui contient des informations composites sur les différentes formes moléculaires résultant des modifications post-traductionnelles (PTM) et de toute différence de structure primaire, telle que les clips ou les variantes de séquence. La facilité et le débit relativement élevés de ces mesures les rendent attrayantes pour la caractérisation et les contrôles de surveillance en cours de processus ^7,8. L’analyse des données pour ces expériences nécessite généralement que l’utilisateur définisse l’espace de recherche des formes moléculaires (gamme de PTM ou d’autres formes moléculaires). Pour les protéines glycosylées, cet espace de recherche est largement déterminé par l’hétérogénéité des glycoformes. Les combinaisons de plusieurs PTM, de configurations de liaisons disulfure et d’autres variations le long de la structure primaire rendent le calcul de toutes les formes moléculaires possibles fastidieux. Par conséquent, le calcul manuel des formes moléculaires possibles est un processus qui prend du temps et des ressources et qui présente un fort potentiel d’erreur humaine.

Nous présentons ici un outil de calcul de masse qui a été développé en tenant compte des caractéristiques les plus importantes des molécules biothérapeutiques, telles que les anticorps monoclonaux, les bsAb, les ADC, etc. L’outil permet d’incorporer facilement des variables de l’espace de recherche pour le calcul cohérent des masses et des compositions élémentaires. La nature modulaire de cet outil permettra de le développer et de l’appliquer au calcul de masse et à l’appariement de masse pour d’autres modalités.

Le module d’interface graphique permet à l’utilisateur de spécifier l’entrée pour le calcul de la masse, comme illustré à la figure 1 ; Plus précisément, l’utilisateur saisit des séquences d’acides aminés d’une seule lettre pour les chaînes d’anticorps légères et lourdes. Les modifications courantes pour la cyclisation N-terminale à chaîne lourde et l’écrêtage de la lysine C-terminale sont incluses sous forme de cases à cocher. De plus, la formule chimique/la composition élémentaire peut être ajoutée/soustraite de ces chaînes protéiques via la zone de texte Chem Mod correspondante. Cela permet à l’utilisateur d’ajouter une composition élémentaire qui comprend de multiples modifications post-traductionnelles ou une charge utile de petites molécules dans le cas d’un ADC. Comme la plupart des anticorps monoclonaux thérapeutiques sont conçus pour éliminer les sites de glycosylation dans la chaîne légère, la glycosylation dans la chaîne légère est facultative et peut être spécifiée à l’aide d’une case à cocher sur l’interface graphique.

Une variante typique de l’analyse de la masse intacte pour les anticorps est une analyse de masse sous-unitaire réduite, où la chaîne légère est détachée de la chaîne lourde en réduisant les liaisons disulfure interchaînes. Selon la force de l’agent réducteur utilisé, les liaisons disulfure intra-chaîne peuvent être clivées ou non. Les utilisateurs ont la possibilité d’entrer le nombre total de liaisons disulfure en fonction du sous-type d’IgG ou dans le cas d’un ADC⁹ conjugué à la cystéine.

L’application calcule les masses de manière ascendante, dans laquelle les compositions élémentaires sont d’abord calculées pour les chaînes lourdes et les chaînes légères individuelles. Ensuite, l’écrêtage de Lys de la cyclisation N-terminale à chaîne lourde (HC) est pris en compte en ajustant les compositions élémentaires calculées. Toutes les modifications chimiques spécifiées sont ensuite appliquées aux chaînes lourdes et/ou légères. En fonction du type d’analyse et des modèles de liaison disulfure spécifiés par l’utilisateur, le nombre d’hydrogènes est ajusté pour les deux chaînes polypeptidiques. Les masses glycosylées HC et de chaîne légère (LC) (en option) sont calculées en fonction de l’entrée de l’utilisateur. Enfin, plusieurs masses HC et LC sont combinées, et les numéros de liaison disulfure sont automatiquement mis à jour pour le calcul de la masse intacte.

Avec des molécules plus grosses telles que des protéines intactes, les masses monoisotopiques ne peuvent pas être mesurées en raison du défaut de masse additif lors de l’utilisation de spectromètres de masse avec un pouvoir de résolution typique. Au lieu de cela, les masses nominales ou moyennes sont mesurées ou déclarées 5,10,11,12,13. Les masses élémentaires moyennes peuvent varier en fonction de la source utilisée pour les masses sélectionnées^14,15. Bien que les différences dans les masses élémentaires puissent être faibles, elles peuvent s’additionner pour atteindre des valeurs significatives pour les calculs de poids moléculaire de grosses molécules. Les masses élémentaires moyennes utilisées par défaut dans l’application logicielle sont indiquées dans le tableau supplémentaire 1. Pour les environnements réglementés comme le domaine de la recherche et du développement (R-D) biopharmaceutique, il est important de maintenir des masses moléculaires constantes, car les changements de masse peuvent impliquer des changements dans l’entité moléculaire lors des dépôts réglementaires. Pour assurer la cohérence de l’utilisation des masses élémentaires, un dictionnaire des masses élémentaires est inclus avec l’outil logiciel sous la forme d’un fichier texte csv (valeurs séparées par des virgules) : Element_Mass.csv (Fichier de codage supplémentaire 1). De même, une liste organisée des compositions de glycanes généralement observées sur les anticorps monoclonaux est incluse : Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Les deux fichiers sont enregistrés dans le même dossier qu’une application exécutable et peuvent être modifiés par l’utilisateur pour utiliser une liste de masse élémentaire spécifique ou une bibliothèque de glycanes.

Figure 1 : Interface graphique de l’application mAbScale. Le module GUI permet à l’utilisateur de spécifier l’entrée pour le calcul de la masse. L’utilisateur saisit des séquences d’acides aminés d’une seule lettre pour les chaînes d’anticorps légères et lourdes. Les modifications courantes pour la cyclisation N-terminale à chaîne lourde et l’écrêtage de la lysine C-terminale sont incluses sous forme de cases à cocher. Les formules chimiques/compositions élémentaires peuvent être ajoutées/soustraites via la zone de texte Chem Mod correspondante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Le flux de travail de haut niveau pour mAbScale est illustré à la figure 2. Chaque étape a des branches de décision internes plus sophistiquées, des boucles et une combinatoire. Un flux de travail algorithmique détaillé décrivant le processus de calcul est présenté dans la figure supplémentaire 1. La sortie de l’application est enregistrée sous forme de feuille de calcul dans le dossier sélectionné par l’utilisateur. Le fichier de sortie se compose de plusi…

Representative Results

Une variété d’anticorps monoclonaux a été sélectionnée pour représenter différents types d’anticorps monoclonaux. Un étalon d’anticorps monoclonaux disponible dans le commerce a été choisi pour représenter un anticorps monoclonal conventionnel avec des chaînes lourdes identiques, des chaînes légères identiques et un site de glycosylation lié à l’azote dans la région Fc. Un anticorps monoclonal avec une glycosylation supplémentaire liée à l’azote à chaîne légère, un anticorps monoclonal…

Discussion

mAbScale fournit une interface utilisateur intuitive avec la possibilité de modifier les blocs de construction pour les calculs de masse et d’élément. On s’attend à ce que les utilisateurs aient une compréhension de base de la molécule cible pour utiliser l’application, en déduire les masses correctes et interpréter les résultats. Par exemple, la feuille de sortie de masse intacte ou réduite peut être écrasante en raison des nombreuses rangées de masses intactes ou réduites, puisque la base de donnée…

Materials

Acquity UPLC system	Waters Corp., Milford, MA	N/A	Modular system
Antibody-drug conjugate (ADC)	GlaxoSmithKline	N/A	Proprietory molecule
BEH 200 SEC column	Waters Corp., Milford, MA	176003904
Bispecific mAb	GlaxoSmithKline	N/A	Proprietory molecule
Byos	Protein Metrics, Cupertino, CA	https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5
GPMAW	GPMAW	http://www.gpmaw.com/
LC-MS grade water	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	W6-1
mAb standard	Waters Corp., Milford, MA	186009125	Waters Humanized mAb Mass Check Standard
mAbScale	GlaxoSmithKline	Apache License, Version 2.0
Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer	Waters Corp., Milford, MA	N/A	Modular system