Normothermic Ex vivo levermaskinperfusjon i mus
Summary
Et normoterm ex vivo leverperfusjonssystem (NEVLP) ble opprettet for muselever. Dette systemet krever erfaring innen mikrokirurgi, men gir mulighet for reproduserbare perfusjonsresultater. Evnen til å bruke muselever letter undersøkelsen av molekylære veier for å identifisere nye perfusatadditiver og muliggjør utførelse av eksperimenter fokusert på organreparasjon.
Abstract
Denne protokollen presenterer et optimalisert erytrocyttfritt NEVLP-system ved hjelp av muselever. Ex vivo bevaring av muselever ble oppnådd ved å bruke modifiserte kanyler og teknikker tilpasset konvensjonelt kommersielt ex vivo perfusjonsutstyr. Systemet ble brukt til å evaluere bevaringsresultatene etter 12 timers perfusjon. C57BL/6J-mus fungerte som leverdonorer, og leveren ble eksplantet ved kanylering av portvenen (PV) og gallegangen (BD), og deretter skylling av organet med varmt (37 °C) heparinisert saltvann. Deretter ble de eksplanterte leverene overført til perfusjonskammeret og utsatt for normoterm oksygenert maskinperfusjon (NEVLP). Innløps- og utløpsperfusatprøver ble samlet med 3 timers intervaller for perfusatanalyse. Etter fullført perfusjon ble leverprøver tatt for histologisk analyse, med morfologisk integritet vurdert ved hjelp av modifisert Suzuki-Score gjennom Hematoksylin-Eosin (HE) farging. Optimaliseringsforsøkene ga følgende funn: (1) mus som veide over 30 g ble ansett som mer egnet for forsøket på grunn av den større størrelsen på gallekanalen (BD). (2) en 2 Fr (ytre diameter = 0,66 mm) polyuretankanyle var bedre egnet til kanylering av portvenen (PV) sammenlignet med en polypropylenkanyle. Dette ble tilskrevet polyuretanmaterialets forbedrede grep, noe som resulterte i redusert kateterglidning under overføringen fra kroppen til organkammeret. (3) for kanylering av gallegangen (BD) ble en 1 Fr (ytre diameter = 0,33 mm) polyuretankanyle funnet å være mer effektiv sammenlignet med polypropylen UT – 03 (ytre diameter = 0,30 mm) kanyle. Med denne optimaliserte protokollen ble muselever bevart i en varighet på 12 timer uten signifikant innvirkning på den histologiske strukturen. Farging av hematoksylin-eosin (HE) avslørte en godt bevart morfologisk arkitektur i leveren, karakterisert ved overveiende levedyktige hepatocytter med tydelig synlige kjerner og mild utvidelse av leversinusoider.
Introduction
Levertransplantasjon representerer gullstandardbehandlingen for personer med leversykdom i sluttstadiet. Dessverre overgår etterspørselen etter donororganer det tilgjengelige tilbudet, noe som fører til en betydelig mangel. I 2021 sto ca. 24 936 pasienter på venteliste for levertransplantasjon, mens kun 9 234 transplantasjoner ble utført1. Den betydelige forskjellen mellom tilbud og etterspørsel av levertransplantater fremhever den presserende nødvendigheten av å undersøke alternative strategier for å utvide donorbassenget og forbedre tilgjengeligheten av levertransplantater. En måte å utvide donorpoolen på er å bruke marginale donorer2. Marginale givere inkluderer de med avansert alder, moderat eller alvorlig steatose. Selv om transplantasjon av marginale organer kan gi gunstige resultater, forblir de samlede resultatene suboptimale. Som et resultat er utviklingen av terapeutiske strategier rettet mot å styrke funksjonen til marginale donorer for tiden i gang 3,4.
En av strategiene er å bruke maskinperfusjon, spesielt normoterm oksygenert maskinperfusjon, for å forbedre funksjonen til disse marginale organene5. Imidlertid er det fortsatt en begrenset forståelse av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for de gunstige effektene av normoterm oksygenert maskinperfusjon (NEVLP). Mus, med sin rikelig tilgjengelighet av genetisk modifiserte stammer, tjener som verdifulle modeller for å undersøke molekylære veier. For eksempel har betydningen av autofagibaner for å redusere leveriskemi-reperfusjonsskade blitt stadig mer anerkjent 6,7. En viktig molekylær vei i leveriskemi-reperfusjonsskade er miR-20b-5p / ATG7-banen8. For tiden er det en rekke ATG knockout og betingede knock-out musestammer tilgjengelig, men ingen tilsvarende rottestammer9.
Basert på denne bakgrunnen var målet å generere en miniatyrisert NEVLP-plattform for muselevertransplantater. Denne plattformen vil legge til rette for utforskning og evaluering av potensielle genmodifiserte strategier for å forbedre funksjonaliteten til donorens lever. I tillegg var det viktig at systemet var egnet for langvarig perfusjon, noe som muliggjorde ex vivo-behandling av leveren, ofte referert til som “organreparasjon”.
Tatt i betraktning den begrensede tilgjengeligheten av relevante in vitro-data om perfusjon hos mus, fokuserte litteraturgjennomgangen på studier utført på rotter. Et systematisk litteratursøk fra 2010 til 2022 ble utført med søkeord som «normoterm leverperfusjon», «ex vivo eller in vitro» og «rotter». Dette søket hadde som mål å identifisere optimale forhold hos gnagere, slik at vi kunne bestemme den mest hensiktsmessige tilnærmingen.
Perfusjonssystemet består av et forseglet vannkappet glassbufferreservoar, en peristaltisk rullepumpe, en oksygenator, en boblefelle, en varmeveksler, et orgelkammer og et lukket sykkelslangesystem (figur 1). Systemet sikrer presist vedlikehold av en konstant perfusjonstemperatur på 37 °C ved hjelp av en dedikert termostatmaskin. Den peristaltiske rullepumpen driver strømmen av perfusatet gjennom hele kretsløpet. Perfusjonskretsen starter ved det isolerte vannkappede reservoaret. Deretter ledes perfusatet gjennom oksygenatoren, som mottar en gassblanding av 95% oksygen og 5% karbondioksid fra en dedikert gassflaske. Etter oksygenering passerer perfusatet gjennom boblefellen, hvor eventuelle innesluttede bobler blir omdirigert tilbake til reservoaret av den peristaltiske pumpen. Det gjenværende perfusatet strømmer gjennom varmeveksleren og kommer inn i orgelkammeret, hvorfra det vender tilbake til reservoaret.
Her rapporterer vi våre erfaringer med å etablere en NEVLP for muselever og deler de lovende resultatene av et piloteksperiment utført ved bruk av det oksygenerte mediet uten oksygenbærere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
De to avgjørende trinnene i levereksplantasjon er kanylering av portalvenen (PV) og den påfølgende kanylering av gallekanalen (BD). Disse trinnene er av avgjørende betydning for å sikre vellykket organuthenting og påfølgende perfusjons- eller transplantasjonsprosedyrer.
Utfordringer og løsninger
PV-kanylering gir tre utfordringer: skade på karveggen, forskyvning av kateteret og gjennomførbarhet av innføringsprosess…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gjennom skrivingen av denne artikkelen har jeg fått mye støtte og hjelp. Jeg vil spesielt takke min lagkamerat XinPei Chen for hans fantastiske samarbeid og tålmodige støtte under operasjonen.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
Riferimenti
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
- van der, V. a. l. k. . J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) – farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von, C., Horn, H., Zlatev, J., Pletz, B., Lüer, T., Minor, Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William’s E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
