זילוח מכונת כבד Normothermic Ex Vivo בעכבר
Summary
מערכת זילוח כבד נורמותרמית ex vivo (NEVLP) נוצרה עבור כבדי עכברים. מערכת זו דורשת ניסיון במיקרו-כירורגיה אך מאפשרת תוצאות זילוח הניתנות לשחזור. היכולת להשתמש בכבדים של עכברים מאפשרת לחקור מסלולים מולקולריים לזיהוי תוספי פרבוסט חדשים ומאפשרת ביצוע ניסויים המתמקדים בתיקון איברים.
Abstract
פרוטוקול זה מציג מערכת NEVLP אופטימלית ללא אריתרוציטים באמצעות כבדי עכבר. שימור Ex vivo של כבדי עכברים הושג על ידי שימוש בצינוריות וטכניקות מותאמות מציוד זילוח מסחרי קונבנציונלי. המערכת שימשה להערכת תוצאות השימור לאחר 12 שעות של זילוח. עכברי C57BL/6J שימשו כתורמי כבד, והכבדים הושתלו על ידי קנולציה של וריד הפורטל (PV) וצינור המרה (BD), ולאחר מכן שטיפת האיבר במי מלח חמים (37 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, הכבדים שהושתלו הועברו לתא הזילוח והיו נתונים לזילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית (NEVLP). דגימות פרפוזט כניסה ויציאה נאספו במרווחים של 3 שעות לצורך ניתוח פרפוזאט. עם השלמת הזלוף, דגימות כבד התקבלו לניתוח היסטולוגי, עם שלמות מורפולוגית שהוערכה באמצעות Suzuki-Score שונה באמצעות צביעת Hematoxylin-Eosin (HE). ניסויי האופטימיזציה הניבו את הממצאים הבאים: (1) עכברים במשקל של מעל 30 גרם נחשבו מתאימים יותר לניסוי בשל גודלו הגדול יותר של צינור המרה שלהם (BD). (2) צינורית פוליאוריתן 2 Fr (קוטר חיצוני = 0.66 מ”מ) התאימה יותר לקנולציה של הווריד הפורטלי (PV) בהשוואה לצינורית פוליפרופילן. זה יוחס לאחיזה המשופרת של חומר הפוליאוריתן, וכתוצאה מכך החלקת קטטר מופחתת במהלך המעבר מהגוף לתא האיבר. (3) עבור קנולציה של צינור המרה (BD), צינורית פוליאוריתן 1 Fr (קוטר חיצוני = 0.33 מ”מ) נמצאה יעילה יותר בהשוואה לצינורית פוליפרופילן UT – 03 (קוטר חיצוני = 0.30 מ”מ). בעזרת פרוטוקול אופטימלי זה, כבדי עכברים נשמרו בהצלחה למשך 12 שעות ללא השפעה משמעותית על המבנה ההיסטולוגי. צביעת Hematoxylin-Eosin (HE) חשפה ארכיטקטורה מורפולוגית שמורה היטב של הכבד, המאופיינת בעיקר hepatocytes קיימא עם גרעינים גלויים בבירור התרחבות קלה של סינוסיואידים בכבד.
Introduction
השתלת כבד מייצגת את תקן הזהב לטיפול באנשים עם מחלת כבד סופנית. למרבה הצער, הביקוש לתרומת איברים עולה על ההיצע הזמין, מה שמוביל למחסור משמעותי. בשנת 2021 היו ברשימת ההמתנה להשתלת כבד כ-24,936 חולים, בעוד שרק 9,234 השתלות בוצעו בהצלחה1. הפער המשמעותי בין ההיצע והביקוש של שתלי כבד מדגיש את הצורך הדחוף לחקור אסטרטגיות חלופיות להרחבת מאגר התורמים ולשיפור הנגישות של שתלי כבד. אחת הדרכים להרחיב את מאגר התורמים היא להשתמש בתורמים שוליים2. תורמים שוליים כוללים אלה עם גיל מתקדם, סטאטוזיס בינוני או חמור. למרות שהשתלת איברים שוליים עשויה להניב תוצאות חיוביות, התוצאות הכלליות נותרות לא אופטימליות. כתוצאה מכך, פיתוח אסטרטגיות טיפוליות שמטרתן לשפר את תפקודם של תורמים שוליים נמצא כיום בעיצומו 3,4.
אחת האסטרטגיות היא להשתמש בזילוח מכונה, במיוחד זילוח מכונה מחומצן נורמתרמי, כדי לשפר את תפקודם של איברים שוליים אלה5. עם זאת, עדיין קיימת הבנה מוגבלת של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההשפעות המועילות של זילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית (NEVLP). עכברים, עם הזמינות השופעת שלהם של זנים מהונדסים גנטית, משמשים מודלים רבי ערך לחקר מסלולים מולקולריים. לדוגמה, המשמעות של מסלולי אוטופגיה בהקלה על פגיעה באיסכמיה בכבד הוכרה יותר ויותר 6,7. מסלול מולקולרי חשוב אחד בפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה בכבד הוא מסלול miR-20b-5p/ATG78. נכון לעכשיו, קיימים מספר זני עכבר מסוג ATG knockout ו-knock-out מותנה, אך אין זני חולדות מתאימים9.
בהתבסס על רקע זה, המטרה הייתה ליצור פלטפורמת NEVLP ממוזערת עבור שתלי כבד עכבר. פלטפורמה זו תקל על חקירה והערכה של אסטרטגיות פוטנציאליות מהונדסות-גנטית שמטרתן לשפר את הפונקציונליות של הכבד של התורם. בנוסף, היה חיוני שהמערכת תתאים לזילוח לטווח ארוך, ותאפשר טיפול ex vivo בכבד, המכונה בדרך כלל “תיקון איברים”.
בהתחשב בזמינות המוגבלת של נתונים רלוונטיים במבחנה על זילוח כבד עכברים, סקירת הספרות התמקדה במחקרים שנערכו בחולדות. חיפוש שיטתי בספרות שנמשכה בין השנים 2010 ל-2022 בוצע באמצעות מילות מפתח כגון “זילוח כבד נורמתרמי”, “ex vivo or in vitro” ו”חולדות“. חיפוש זה נועד לזהות תנאים אופטימליים במכרסמים, ולאפשר לנו לקבוע את הגישה המתאימה ביותר.
מערכת הזילוח מורכבת ממאגר חיץ זכוכית אטום עם מעטפת מים, משאבת גלילים פריסטלטית, מחמצן, מלכודת בועות, מחליף חום, תא איבר ומערכת צינורות אופניים סגורה (איור 1). המערכת מבטיחה תחזוקה מדויקת של טמפרטורת זילוח קבועה של 37°C באמצעות מכונה תרמו-סטטית ייעודית. משאבת הגלילה הפריסטלטית מניעה את זרימת הפרפוסטה לאורך המעגל. מעגל הזילוח מתחיל במאגר המים המבודד. לאחר מכן, הפרפוזט מופנה דרך המחמצן, אשר מקבל תערובת גז של 95% חמצן ו -5% פחמן דו חמצני מבקבוק גז ייעודי. לאחר החמצון, הפרפוזט עובר דרך מלכודת הבועות, שבה כל הבועות הכלואות מנותבות חזרה למאגר על ידי המשאבה הפריסטלטית. הפרבוסט הנותר זורם דרך מחליף החום ונכנס לתא האיברים, משם הוא חוזר למאגר.
כאן, אנו מדווחים על ניסיוננו בהקמת NEVLP עבור כבדי עכברים וחולקים את התוצאות המבטיחות של ניסוי פיילוט שבוצע באמצעות התווך המחומצן ללא נשאי חמצן.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
שני השלבים המכריעים בכריתת הכבד הם קנולציה של הווריד הפורטלי (PV) והקנולציה הבאה של צינור המרה (BD). צעדים אלה הם בעלי חשיבות עליונה בהבטחת שאיבת איברים מוצלחת והליכי זילוח או השתלה לאחר מכן.
אתגרים ופתרונות
קנולציית PV מציבה שלושה …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
לאורך כתיבת מאמר זה קיבלתי תמיכה וסיוע רבים. אני רוצה להודות במיוחד לחבר הצוות שלי XinPei Chen על שיתוף הפעולה הנפלא שלו ותמיכתו במטופלים במהלך הניתוח שלי.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
Riferimenti
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
- van der, V. a. l. k. . J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) – farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von, C., Horn, H., Zlatev, J., Pletz, B., Lüer, T., Minor, Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William’s E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
