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Ingegneria

마우스의 Normothermic Ex Vivo 간 기계 관류

Published: September 25, 2023
doi:
10.3791/65363
, , , ,
1Experimental Transplantation Surgery, Department of General, Visceral and Vascular Surgery,Jena University Hospital, 2Institute of Pathology,Klinikum Chemnitz GmbH, 3Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine,Menoufia University

Summary

정상 체온 생체 외 간 관류(NEVLP) 시스템이 마우스 간을 위해 만들어졌습니다. 이 시스템은 미세 수술에 대한 경험이 필요하지만 재현 가능한 관류 결과를 허용합니다. 마우스 간을 활용하는 능력은 새로운 관류액 첨가제를 식별하기 위한 분자 경로의 조사를 용이하게 하고 장기 복구에 중점을 둔 실험의 실행을 가능하게 합니다.

Abstract

이 프로토콜은 마우스 간을 사용하여 최적화된 적혈구가 없는 NEVLP 시스템을 제공합니다. 마우스 간의 생체 외 보존은 변형된 캐뉼라와 기존의 상업용 생체 외 관류 장비에서 채택된 기술을 사용하여 달성되었습니다. 이 시스템은 12시간의 관류 후 보존 결과를 평가하는 데 활용되었습니다. C57BL/6J 마우스를 간 기증자로 사용하였고, 간을 문맥(PV)과 담관(BD)에 캐뉼라(cannul)시킨 후, 따뜻한(37°C) 헤파린화된 식염수로 장기를 세척하여 이식하였다. 이어서, 이식된 간을 관류실로 옮기고 정상 체온 산소화 기계 관류(NEVLP)를 실시했습니다. 관류액 분석을 위해 입구 및 출구 관류액 샘플을 3시간 간격으로 수집했습니다. 관류가 완료되면 조직학적 분석을 위해 간 샘플을 얻었고, Hematoxylin-Eosin(HE) 염색을 통해 변형된 Suzuki-Score를 사용하여 형태학적 완전성을 평가했습니다. 최적화 실험은 다음과 같은 결과를 산출했다 : (1) 30 g 이상의 마우스는 담관 (BD)의 크기가 더 크기 때문에 실험에 더 적합한 것으로 간주되었다. (2) 2 Fr (외경 = 0.66 mm) 폴리우레탄 캐뉼라는 폴리프로필렌 캐뉼라와 비교할 때 문맥 캐뉼라(PV)를 캐뉼레이팅하는 데 더 적합하였다. 이는 폴리우레탄 소재의 향상된 그립감으로 인해 신체에서 장기 챔버로 이동하는 동안 카테터 미끄러짐이 감소했기 때문입니다. (3) 담관(BD)의 캐뉼라의 경우, 1 Fr(외경 = 0.33 mm) 폴리우레탄 캐뉼라가 폴리프로필렌 UT-03(외경 = 0.30 mm) 캐뉼라에 비해 더 효과적인 것으로 나타났다. 이 최적화된 프로토콜을 사용하여 마우스 간은 조직학적 구조에 큰 영향을 미치지 않고 12시간 동안 성공적으로 보존되었습니다. 헤마톡실린-에오신(HE) 염색은 간에서 잘 보존된 형태학적 구조를 나타냈으며, 이는 명확하게 보이는 핵과 간 정현파의 경미한 확장을 가진 주로 생존 가능한 간세포를 특징으로 합니다.

Introduction

간 이식은 말기 간 질환이 있는 개인을 위한 황금 표준 치료법입니다. 유감스럽게도 기증자 장기에 대한 수요가 가용 공급을 초과하여 심각한 부족 현상이 발생합니다. 2021년에는 약 24,936명의 환자가 간 이식 대기자 명단에 올랐고 9,234건의 이식만이 성공적으로 수행되었습니다1. 간 이식편의 수요와 공급 사이의 상당한 격차는 기증자 풀을 넓히고 간 이식편의 접근성을 향상시키기 위한 대체 전략을 조사해야 할 시급한 필요성을 강조합니다. 기증자 풀을 확장하는 한 가지 방법은 한계 기증자를 사용하는 것입니다2. 한계 기증자에는 고령, 중등도 또는 중증 지방증이 있는 사람이 포함됩니다. 한계 장기의 이식이 유리한 결과를 가져올 수 있지만 전반적인 결과는 차선책으로 남아 있습니다. 결과적으로, 한계 기증자의 기능을 향상시키기위한 치료 전략의 개발이 현재 진행 중이다 3,4.

전략 중 하나는 기계 관류, 특히 정상 체온 산소 기계 관류를 사용하여 이러한 변연 기관의 기능을 향상시키는 것입니다5. 그러나 정상 체온 산소 기계 관류(NEVLP)의 유익한 효과의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 이해는 여전히 제한적입니다. 유전자 변형 균주를 풍부하게 이용할 수 있는 마우스는 분자 경로를 조사하기 위한 귀중한 모델 역할을 합니다. 예를 들어, 간 허혈-재관류 손상을 완화하는 데 있어 자가포식 경로의 중요성이 점점 더 인식되고 있습니다 6,7. 간 허혈-재관류 손상에서 중요한 분자 경로 중 하나는 miR-20b-5p/ATG7 경로8입니다. 현재, 다수의 ATG 녹아웃 및 조건부 녹아웃 마우스 균주가 이용 가능하지만, 상응하는 쥐 균주는 없다9.

이러한 배경을 바탕으로 마우스 간 이식을 위한 소형화된 NEVLP 플랫폼을 생성하는 것이 목표였습니다. 이 플랫폼은 기증자의 간 기능 향상을 목표로 하는 잠재적인 유전자 변형 전략의 탐색 및 평가를 용이하게 합니다. 또한 시스템이 장기 관류에 적합하여 일반적으로 “장기 복구”라고 하는 간의 생체 외 치료가 가능해야 했습니다.

마우스 간 관류에 대한 관련 시험관 내 데이터의 제한된 가용성을 고려하여 문헌 검토는 쥐에서 수행된 연구에 초점을 맞췄습니다. 2010년부터 2022년까지의 문헌에 대한 체계적인 검색은 “정상 체온 간 관류”, “생체 외 또는 시험관 내” 및 “쥐”와 같은 키워드를 사용하여 수행되었습니다. 이 검색은 설치류에서 최적의 조건을 식별하여 가장 적절한 접근 방식을 결정할 수 있도록하는 것을 목표로했습니다.

관류 시스템은 밀폐된 방수 유리 버퍼 저장소, 연동 롤러 펌프, 산소 공급기, 버블 트랩, 열교환기, 오르간 챔버 및 폐쇄형 사이클링 튜브 시스템으로 구성됩니다(그림 1). 이 시스템은 전용 온도 조절기를 사용하여 37°C의 일정한 관류 온도를 정밀하게 유지합니다. 연동 롤러 펌프는 회로 전체에 걸쳐 관류물의 흐름을 구동합니다. 관류 회로는 절연된 워터 재킷 저장소에서 시작됩니다. 그 후, 관류액은 전용 가스통에서 95% 산소와 5% 이산화탄소의 가스 혼합물을 받는 산소 공급기를 통해 전달됩니다. 산소 공급 후, 관류액은 버블 트랩을 통과하며, 여기서 갇힌 버블은 연동 펌프에 의해 저장소로 다시 리디렉션됩니다. 나머지 관류액은 열교환기를 통해 흐르고 오르간 챔버로 들어가 저장소로 돌아갑니다.

여기에서 우리는 마우스 간을 위한 NEVLP를 확립한 경험을 보고하고 산소 운반체 없이 산소가 함유된 배지를 사용하여 수행된 파일럿 실험의 유망한 결과를 공유합니다.

Protocol

동물 실험은 동물 복지에 대한 현행 독일 규정 및 지침과 동물 연구 보고를 위한 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 실험 프로토콜은 독일 튀링겐의 Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz에 의해 승인되었습니다(승인 번호: UKJ – 17 – 106). 참고: 체중이 34± 4g인 수컷 C57BL/6J 마우스(평균 ± 표준 오차[SEM])를 간 기증자로 사용했습니다. 그들은 통제된 환경 조건(50% 습도 및 18 – 23 °C)…

Representative Results

외과 절차의 확립이 실험에는 총 17마리의 동물이 활용되었다: 14마리의 마우스는 문맥(PV) 및 담관(BD)의 캐뉼라 삽입을 포함하여 장기 조달 과정을 최적화하기 위해 사용되었고, 3마리의 마우스는 절차를 검증하는 데 사용되었다(표 1). 조직학적 결과(도 3)는 최적의 관류 조건의 식별을 용이하게 하기 위해 비교되었다. ?…

Discussion

프로토콜의 중요한 단계
간 이식의 두 가지 중요한 단계는 문맥의 캐뉼라 삽입(PV)과 후속 담관 캐뉼라(BD)입니다. 이러한 단계는 성공적인 장기 회수 및 후속 관류 또는 이식 절차를 보장하는 데 가장 중요합니다.

도전과 해결책
PV 캐뉼러는 혈관벽의 손상, 카테터의 변위 및 삽입 과정의 실행 가능성이라는 세 가지 문제를 제시합니다. PV 혈관 벽의…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 논문을 쓰는 동안 나는 많은 지원과 도움을 받았다. 특히 제 수술 중 훌륭한 협력과 환자 지원에 대해 팀 동료 XinPei Chen에게 감사드립니다.

Materials

0.5 ml Micro Tube PP Sarstedt 72699
1 Fr Rubber Cannula Vygon Sample Cannula
10 µL Micro Syringe Hamilton 701N
2 Fr Rubber Cannula Vygon Sample Cannula
24 G Butterfly Cannula Terumo SR+OF2419
26 G Butterfly Cannula Terumo SR+DU2619WX
30 G Hypodermic Needle Sterican 100246
50 ml Syringe Pump Braun 110356
6-0 Perma-Hand Seide Ethicon 639H
Arterial Clip Braun BH014R
Autoclavable Moist Chamber Hugo Sachs Elektronik 73-4733
Big Cotton Applicator  NOBA Verbandmittel Danz GmbH 974018
Bubble Trap Hugo-Sachs-Elektronik V83163
Buprenovet (0.3 mg / ml) Elanco /
CIDEX OPA solution (2 L) Cilag GmbH 20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C ERBE /
Fetal Bovine Serum(500 ml)  Sigma-Aldrich F7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) House Supply /
Heating Circulating Baths Harvard-Apparatus 75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml) Braun 1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) Pfizer 15427276
Insulin(100 IE / ml) Sigma I0516-5ML
Iris Scissors  Fine Science Instruments 15000-03
Isofluran (250 ml) Cp-Pharma 1214
Membrane Oxygenator Hugo Sachs Elektronik T18728
Microsurgery Microscope  Leica M60
Mouse Retractor Set  Carfil Quality 180000056
NanoZoomer 2.0 HT Hamamatsu /
Non-Woven Sponges  Kompressen 866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)  C.C.Pro Z-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm) Braun 4256000
Peristaltic Pump Harvard-Apparatus P-70
Petri Dishc 100×15 mm VWR® 391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) Livisto 799-416
Pressure Transducer Simulator UTAH Medical Products 650-950
Reusable Blood Pressure Transducers AD Instruments MLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation Forceps Fine Science Instruments 00608-11
Small Cotton Applicator NOBA Verbandmittel Danz GmbH 974116
Straight Forceps 10 cm  Fine Science Instruments 00632-11
Suture Tying Forceps Fine Science Instruments 11063-07
Syringe 50ml Original Perfusor Braun 8728810F-06
UT – 03 Cannula Unique Medical, Japan /
Vannas Spring Scissors Fine Science Instruments 15018-10
Veterinary Saline (500 ml) WDT 18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L Harvard-Apparatus 73-3441
William's E Medium (500 ML) Thermofischer Scientific A1217601
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Riferimenti

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Keywords: NormothermicEx-vivoLiverMachine PerfusionMouseMolecular MechanismsGenetically Modified AnimalsTransgenic MiceThermostatic ControllerPeristaltic PumpOxygenatorBubble TrapPortal VeinSuprahepatic CavaBile DrainageSemi-sterile30G Needle26G CatheterHeparinized SalineOrgan ChamberRoller PumpHeat Exchanger
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Chen, H., Dirsch, O., Albadry, M., Ana, P. H., Dahmen, U. Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse. J. Vis. Exp. (199), e65363, doi:10.3791/65363 (2023).
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