Normotherme ex vivo Lebermaschinenperfusion bei Mäusen
Summary
Für die Leber von Mäusen wurde ein normothermisches ex vivo Leberperfusionssystem (NEVLP) entwickelt. Dieses System erfordert Erfahrung in der Mikrochirurgie, ermöglicht aber reproduzierbare Perfusionsergebnisse. Die Möglichkeit, Mäuselebern zu verwenden, erleichtert die Untersuchung molekularer Signalwege zur Identifizierung neuartiger Perfusat-Additive und ermöglicht die Durchführung von Experimenten, die sich auf die Reparatur von Organen konzentrieren.
Abstract
Dieses Protokoll stellt ein optimiertes erythrozytenfreies NEVLP-System unter Verwendung von Mauslebern dar. Die Ex-vivo-Konservierung von Mäuselebern wurde durch den Einsatz modifizierter Kanülen und Techniken erreicht, die von konventionellen kommerziellen Ex-vivo-Perfusionsgeräten übernommen wurden. Das System wurde verwendet, um die Konservierungsergebnisse nach 12 h Perfusion zu bewerten. C57BL/6J-Mäuse dienten als Leberspender, und die Lebern wurden explantiert, indem die Pfortader (PV) und der Gallengang (BD) kanüliert und das Organ anschließend mit warmer (37 °C) heparinisierter Kochsalzlösung gespült wurde. Anschließend wurden die explantierten Lebern in die Perfusionskammer überführt und einer normothermen oxygenierten maschinellen Perfusion (NEVLP) unterzogen. Die Einlass- und Auslassproben des Perfusats wurden in Abständen von 3 Stunden zur Perfusatanalyse entnommen. Nach Abschluss der Perfusion wurden Leberproben zur histologischen Analyse entnommen, wobei die morphologische Integrität mittels modifiziertem Suzuki-Score durch Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung beurteilt wurde. Die Optimierungsexperimente ergaben folgende Ergebnisse: (1) Mäuse mit einem Gewicht von über 30 g wurden aufgrund der größeren Größe ihres Gallengangs (BD) als besser geeignet für das Experiment erachtet. (2) Eine 2 Fr (Außendurchmesser = 0,66 mm) Polyurethankanüle war im Vergleich zu einer Polypropylenkanüle besser für die Kanülierung der Pfortader (PV) geeignet. Dies wurde auf die verbesserte Griffigkeit des Polyurethanmaterials zurückgeführt, die zu einem geringeren Katheterschlupf während des Transfers vom Körper in die Organkammer führte. (3) Für die Kanülierung des Gallengangs (BD) erwies sich eine 1 Fr (Außendurchmesser = 0,33 mm) Polyurethankanüle als wirksamer als die Polypropylenkanüle UT – 03 (Außendurchmesser = 0,30 mm). Mit diesem optimierten Protokoll konnten Mauslebern erfolgreich für eine Dauer von 12 Stunden konserviert werden, ohne dass die histologische Struktur signifikant beeinflusst wurde. Die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung ergab eine gut erhaltene morphologische Architektur der Leber, die durch überwiegend lebensfähige Hepatozyten mit deutlich sichtbaren Zellkernen und eine leichte Dilatation der hepatischen Sinusoide gekennzeichnet ist.
Introduction
Die Lebertransplantation stellt den Goldstandard für die Behandlung von Personen mit Lebererkrankungen im Endstadium dar. Bedauerlicherweise übersteigt die Nachfrage nach Spenderorganen das verfügbare Angebot, was zu einer erheblichen Verknappung führt. Im Jahr 2021 standen etwa 24.936 Patienten auf der Warteliste für ein Lebertransplantat, während nur 9.234 Transplantationen erfolgreich durchgeführt wurden1. Die erhebliche Diskrepanz zwischen Angebot und Nachfrage nach Lebertransplantaten unterstreicht die dringende Notwendigkeit, alternative Strategien zur Erweiterung des Spenderpools und zur Verbesserung der Zugänglichkeit von Lebertransplantaten zu untersuchen. Eine Möglichkeit, den Spenderpool zu erweitern, ist der Einsatz von marginalen Spendern2. Zu den marginalen Spendern gehören Personen mit fortgeschrittenem, mittelschwerer oder schwerer Steatose. Obwohl die Transplantation von marginalen Organen zu günstigen Ergebnissen führen kann, bleiben die Gesamtergebnisse suboptimal. Daher ist derzeit die Entwicklung therapeutischer Strategien im Gange, die darauf abzielen, die Funktion marginaler Spender zu verbessern 3,4.
Eine der Strategien besteht darin, die maschinelle Perfusion, insbesondere die normotherme sauerstoffhaltige maschinelle Perfusion, zu nutzen, um die Funktion dieser marginalen Organe zu verbessern5. Es gibt jedoch noch ein begrenztes Verständnis der molekularen Mechanismen, die den positiven Effekten der normothermen oxygenierten maschinellen Perfusion (NEVLP) zugrunde liegen. Mäuse mit ihrer reichlichen Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen dienen als wertvolle Modelle für die Untersuchung molekularer Signalwege. So wurde beispielsweise die Bedeutung von Autophagie-Signalwegen bei der Linderung von Leberischämie-Reperfusionsschäden zunehmend anerkannt 6,7. Ein wichtiger molekularer Signalweg bei der hepatischen Ischämie-Reperfusions-Schädigung ist der miR-20b-5p/ATG7-Signalweg8. Derzeit gibt es eine Reihe von ATG-Knockout- und bedingten Knockout-Mausstämmen, aber keine entsprechenden Rattenstämme9.
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel, eine miniaturisierte NEVLP-Plattform für Lebertransplantate von Mäusen zu generieren. Diese Plattform würde die Erforschung und Bewertung potenzieller genetisch veränderter Strategien zur Verbesserung der Funktionalität der Leber des Spenders erleichtern. Darüber hinaus war es wichtig, dass das System für eine langfristige Perfusion geeignet ist, um die Ex-vivo-Behandlung der Leber zu ermöglichen, die gemeinhin als “Organreparatur” bezeichnet wird.
In Anbetracht der begrenzten Verfügbarkeit relevanter In-vitro-Daten zur Leberperfusion von Mäusen konzentrierte sich die Literaturrecherche auf Studien, die an Ratten durchgeführt wurden. Eine systematische Literaturrecherche aus den Jahren 2010 bis 2022 wurde anhand von Schlagworten wie “normotherme Leberperfusion”, “ex vivo oder in vitro” und “Ratten” durchgeführt. Diese Suche zielte darauf ab, optimale Bedingungen für Nagetiere zu identifizieren, so dass wir den am besten geeigneten Ansatz bestimmen konnten.
Das Perfusionssystem besteht aus einem abgedichteten, wasserummantelten Glaspufferreservoir, einer peristaltischen Rollenpumpe, einem Oxygenator, einer Blasenfalle, einem Wärmetauscher, einer Orgelkammer und einem geschlossenen Schlauchsystem (Abbildung 1). Das System gewährleistet die präzise Aufrechterhaltung einer konstanten Perfusionstemperatur von 37 °C mit einer speziellen thermostatischen Maschine. Die peristaltische Rollenpumpe treibt den Durchfluss des Perfusats durch den gesamten Kreislauf. Der Perfusionskreislauf beginnt am isolierten, wasserummantelten Reservoir. Anschließend wird das Perfusat durch den Oxygenator geleitet, der aus einer speziellen Gasflasche ein Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid erhält. Nach der Sauerstoffanreicherung durchläuft das Perfusat die Blasenfalle, in der alle eingeschlossenen Blasen von der Peristaltikpumpe zurück in das Reservoir geleitet werden. Das verbleibende Perfusat fließt durch den Wärmetauscher und gelangt in den Orgelraum, von wo aus es in den Vorratsbehälter zurückkehrt.
Hier berichten wir über unsere Erfahrungen bei der Etablierung eines NEVLP für Mauslebern und teilen die vielversprechenden Ergebnisse eines Pilotversuchs, das mit dem sauerstoffhaltigen Medium ohne Sauerstoffträger durchgeführt wurde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte im Protokoll
Die beiden entscheidenden Schritte bei der Leberexplantation sind die Kanülierung der Pfortader (PV) und die anschließende Kanülierung des Gallengangs (BD). Diese Schritte sind von größter Bedeutung, um eine erfolgreiche Organentnahme und anschließende Perfusions- oder Transplantationsverfahren zu gewährleisten.
Herausforderungen und Lösungen
Die PV-Kanülierung stellt drei Herausforderungen dar: Verletzung der Gef…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Während des Schreibens dieses Artikels habe ich viel Unterstützung und Hilfe erhalten. Besonders bedanken möchte ich mich bei meinem Teamkollegen XinPei Chen für die wunderbare Zusammenarbeit und die geduldige Unterstützung während meiner Operation.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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