Metodi per l'elettroporazione e la conferma della trasformazione in Limosilactobacillus reuteri DSM20016
Summary
Qui, presentiamo i protocolli per lavorare con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, dettagliando la crescita, la trasformazione plasmidica, la PCR delle colonie, la misurazione della proteina reporter fluorescente e la mini-preparazione limitata del plasmide, nonché problemi comuni e risoluzione dei problemi. Questi protocolli consentono la misurazione delle proteine reporter in DSM20016, o la conferma tramite colony PCR se nessun reporter è coinvolto.
Abstract
Lactobacillus erano un genere incredibilmente grande e diversificato di batteri comprendente 261 specie, molte delle quali erano ceppi commensali con il potenziale per l’uso come telaio per sforzi biologici sintetici all’interno del tratto gastrointestinale. L’ampia variazione fenotipica e genotipica osservata all’interno del genere ha portato a una recente riclassificazione e all’introduzione di 23 nuovi generi.
A causa dell’ampiezza delle variazioni all’interno dei vecchi generi, i protocolli dimostrati in un membro potrebbero non funzionare come pubblicizzato con altri membri. La mancanza di informazioni centralizzate su come manipolare esattamente ceppi specifici ha portato a una serie di approcci ad hoc , spesso adattati da altre famiglie batteriche. Ciò può complicare le cose per i ricercatori che iniziano sul campo, che potrebbero non sapere quali informazioni si applicano o meno al ceppo scelto.
In questo articolo, miriamo a centralizzare una serie di protocolli con dimostrato successo, in particolare nella designazione del ceppo F275 di Limosilactobacillus reuteri (altri numeri di raccolta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), insieme a consigli per la risoluzione dei problemi e problemi comuni che si possono incontrare. Questi protocolli dovrebbero consentire a un ricercatore con poca o nessuna esperienza di lavoro con L. reuteri DSM20016 di trasformare un plasmide, confermare la trasformazione e misurare il feedback del sistema in un lettore di piastre tramite una proteina reporter.
Introduction
Il genere Lactobacillus è stato storicamente classificato come gram-positivo, a forma di bastoncello, non sporigeno, anaerobi facoltativi o microaerofili che scompongono gli zuccheri per produrre principalmente acido lattico1. Questi criteri sciolti hanno portato Lactobacillus ad essere, fenotipicamente e genotipicamente, un genere estremamente diversificato. Questa ampia categorizzazione ha portato alla riclassificazione del genere, introducendo 23 nuovi generi nel 20202.
Il vecchio e più ampio genere comprendeva le principali specie commensali e probiotiche generalmente considerate sicure (GRAS) per il consumo3. La famiglia delle Lactobacillaceae mantiene una percezione pubblica di essere “batteri buoni” a causa di molti benefici per la salute segnalati attraverso il consumo di vari ceppi 4,5,6,7. La facilità con cui possono navigare nel tratto gastrointestinale8 e la loro accettazione pubblica si combinano per posizionare i ceppi di Lactobacillaceae come candidati forti come organismi del telaio per applicazioni medicinali, terapeutiche o diagnostiche ingeribili.
L’ampia gamma di caratteristiche presenti all’interno della famiglia delle Lactobacillaceae ha portato ad una situazione in cui non esiste di fatto un ceppo modello-organismo; I gruppi di ricerca hanno teso a selezionare le specie con le proprietà più rilevanti per i loro obiettivi particolari. (Ad esempio, i laboratori di fermentazione lattiero-casearia potrebbero scegliere L. lactis; gli studi sulla fermentazione vegetale potrebbero selezionare L. plantarum; la ricerca sui probiotici potrebbe concentrarsi su L. acidophilus; e così via.)
Questa stessa vasta gamma di caratteristiche tra le specie ha portato a un accumulo di protocolli e procedure che possono funzionare bene per un sottogruppo della famiglia delle Lactobacillaceae , ma richiedono un’ottimizzazione per funzionare in modo efficiente (o forse per funzionare affatto) in altri9. Questa necessità di ottimizzazione tra i membri della famiglia e anche all’interno di membri della stessa specie può vanificare gli sforzi di ricercatori non familiari. I protocolli pubblicati nelle sezioni dei metodi dei documenti possono anche includere le proprie modifiche10, portando a raccolte di protocolli frammentate e decentralizzate.
L. reuteri è considerato un commensale ampiamente vertebrato, trovato costantemente nei tratti gastrointestinali (GI) di mammiferi, uccelli11 e pesci12. I sottoceppi di L. reuteri sono spesso geneticamente specializzati, attraverso l’adattamento delle proteine di adesione del muco, per colonizzare in modo più permanente specifici ospiti nativi 8,11,13. Le specie di Limosilactobacillus del tratto gastrointestinale possono essere isolate in ospiti al di fuori del loro ospite nativo, ma tendono più verso una natura transitoria8.
A causa della specializzazione uomo-ospite, L. reuteri DSM20016 si posiziona molto bene come telaio per applicazioni diagnostiche o terapeutiche in qualsiasi punto del tratto gastrointestinale umano e il ceppo DSM20016 potrebbe fornire una finestra di effetto più duratura per gli interventi rispetto a ceppi più transitori.
In questo articolo, delineiamo una serie di protocolli con efficacia dimostrata in Limosilactobacillus reuteri (designazione del ceppo: F275; altri numeri di raccolta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), insieme a informazioni centralizzate sul ceppo da altre fonti per aiutare nelle applicazioni di biologia molecolare e dei sistemi. Le procedure qui descritte dovrebbero consentire a un ricercatore senza esperienza precedente di coltura di L. reuteri, creare stock elettrocompetenti, selezionare colonie trasformate, confermare la trasformazione tramite reazione a catena della polimerasi di colonia (PCR) e misurare la risposta del sistema progettato tramite proteine reporter fluorescenti.
Notiamo che i protocolli correlati hanno riguardato la ricombinazione del genoma ssDNA assistito da CRISPR-Cas9 in L. reuteri (ceppo: ATCC-PTA-6475)14 e l’editing del genoma assistito da nickase-CRSIPR-Cas9 in più non-L. reuteri, Lactobacillaceae famiglia colorazioni15,16; questi, tuttavia, non affrontano il ceppo di L. reuteri DSM20016 che è il nostro obiettivo qui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il passo più critico per la trasformazione di L. reuteri DSM20016 è la generazione di condizioni di crescita anaerobica dopo che le trasformazioni sono state placcate; le colonie acquisite in condizioni aerobiche sono solo molto occasionali e generalmente non riescono a crescere quando inoculate nel brodo MRS. Placcare l’intero volume di recupero dovrebbe anche essere praticato per massimizzare la probabilità di crescita della colonia. Anche con queste due fasi critiche, l’efficienza della trasformazione è a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apprezziamo molto i preziosi consigli forniti dal Prof. J.P. van Pijkeren (Università del Wisconsin-Madison), la cui guida sul lavoro con L. reuteri ATCC PTA 6475 ha fornito una base per i metodi qui descritti.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
Riferimenti
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