Методы подтверждения электропорации и трансформации Limosilactobacillus reuteri DSM20016
Summary
Здесь мы представляем протоколы работы с DSM20016 Limosilactobacillus reuteri , подробно описывающие рост, трансформацию плазмиды, ПЦР колоний, измерение флуоресцентного репортерного белка и ограниченную мини-подготовку плазмиды, а также распространенные проблемы и устранение неполадок. Эти протоколы позволяют измерять репортерные белки в DSM20016 или подтверждать с помощью колонии ПЦР, если репортер не участвует.
Abstract
Lactobacillus были невероятно большим, разнообразным родом бактерий, включающим 261 вид, некоторые из которых были комменсальными штаммами с потенциалом для использования в качестве шасси для синтетических биологических исследований в желудочно-кишечном тракте. Широкая фенотипическая и генотипическая изменчивость, наблюдаемая в пределах рода, привела к недавней реклассификации и введению 23 новых родов.
Из-за широты вариаций в старых родах протоколы, продемонстрированные в одном члене, могут не работать так, как рекламируется с другими членами. Отсутствие централизованной информации о том, как именно манипулировать конкретными штаммами, привело к появлению ряда специальных подходов, часто адаптированных из других семейств бактерий. Это может усложнить ситуацию для исследователей, начинающих работать в этой области, которые могут не знать, какая информация относится или не относится к выбранному ими штамму.
В этой статье мы стремимся централизовать набор протоколов с продемонстрированным успехом, в частности, в обозначении штамма Limosilactobacillus reuteri F275 (другие коллекционные номера: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), а также советы по устранению неполадок и общие проблемы, с которыми можно столкнуться. Эти протоколы должны позволить исследователю, практически не имеющему опыта работы с L. reuteri , DSM20016 трансформировать плазмиду, подтверждать трансформацию и измерять обратную связь системы в считывателе планшетов с помощью репортерного белка.
Introduction
Род Lactobacillus исторически классифицировался как грамположительные, палочковидные, неспорообразующие, факультативные анаэробы или микроаэрофилы, которые расщепляют сахара с образованием молочной кислоты1. Эти свободные критерии привели к тому, что Lactobacillus фенотипически и генотипически является чрезвычайно разнообразным родом. Эта широкая категоризация привела к тому, что род был реклассифицирован, и в 2020 году было введено 23 новых рода2.
Старый, более широкий род включал основные комменсальные и пробиотические виды, которые обычно считаются безопасными (GRAS) для потребления3. Семейство Lactobacillaceae поддерживает общественное восприятие как «хороших бактерий» из-за многих сообщений о пользе для здоровья, получаемой за счет потребления различных штаммов4,5,6,7. Легкость, с которой они могут перемещаться по желудочно-кишечному тракту8, и их общественное признание в совокупности позиционируют штаммы Lactobacillaceae как сильных кандидатов в качестве организмов-шасси для приема внутрь в медицинских, терапевтических или диагностических целях.
Широкий спектр характеристик, присутствующих в семействе Lactobacillaceae , привел к ситуации, в которой де-факто нет штамма модельного организма; Исследовательские группы, как правило, отбирают виды со свойствами, наиболее соответствующими их конкретным целям. (Например, лаборатории молочной ферментации могут выбрать L. lactis; исследования ферментации овощей могут выбрать L. plantarum; исследования пробиотиков могут быть сосредоточены на L. acidophilus; и так далее.)
Этот же широкий диапазон характеристик у разных видов привел к накоплению протоколов и процедур, которые могут хорошо работать для одного подмножества семейства Lactobacillaceae , но требуют оптимизации для эффективной работы (или, возможно, для функционирования вообще) в других9. Эта потребность в оптимизации между членами семьи и даже внутри членов одного и того же вида может свести на нет усилия незнакомых исследователей. Протоколы, опубликованные в разделах статей, посвященных методам, могут также включать свои собственные модификации10, что приводит к фрагментированным, децентрализованным коллекциям протоколов.
L. reuteri считается широко распространенным комменсалом позвоночных, постоянно встречающимся в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) млекопитающих,11 птиц ирыб 12. Субштаммы L. reuteri часто генетически специализированы посредством адаптации белка адгезии слизи, чтобы более постоянно колонизировать конкретных местных хозяев 8,11,13. Виды Limosilactobacillus желудочно-кишечного тракта могут быть изолированы у хозяев за пределами их родного хозяина, но больше тяготеют к преходящему характеру8.
Из-за специализации человека и хозяина L. reuteri DSM20016 очень хорошо позиционирует себя в качестве шасси для диагностического или терапевтического применения в любой точке желудочно-кишечного тракта человека, и штамм DSM20016 может обеспечить более длительное окно эффекта для вмешательств по сравнению с более преходящими штаммами.
В этой статье мы описываем ряд протоколов с продемонстрированной эффективностью в отношении Limosilactobacillus reuteri (обозначение штамма: F275; другие коллекционные номера: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), а также централизованную информацию о штамме из других источников, чтобы помочь в приложениях молекулярной и системной биологии. Процедуры, изложенные в настоящем документе, должны позволить исследователю, не имеющему предшествующего опыта, культивировать L. reuteri, создавать электрокомпетентные запасы, отбирать трансформированные колонии, подтверждать трансформацию с помощью колониальной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и измерять сконструированный системный ответ с помощью флуоресцентных репортерных белков.
Мы отмечаем, что соответствующие протоколы охватывали рекомбинацию генома ssDNA с помощью CRISPR-Cas9 у L. reuteri (штамм: ATCC-PTA-6475)14 и редактирование генома с помощью никазы CRSIPR-Cas9 в нескольких не-L. reuteri, окрашивание семейства Lactobacillaceae 15,16; они, однако, не относятся к штамму L. reuteri DSM20016, на котором мы сосредоточены здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важным шагом для трансформации L. reuteri DSM20016 является создание анаэробных условий роста после нанесения покрытий на трансформацию; колонии, полученные в аэробных условиях, встречаются очень редко и, как правило, не растут при инокуляции в бульон MRS. Также следует практикова?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы высоко ценим ценные советы, предоставленные профессором Й.. ван Пейкереном (Университет Висконсин-Мэдисон), чье руководство по работе с L. reuteri ATCC PTA 6475 послужило основой для описанных здесь методов.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
Riferimenti
- Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
- Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
- Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
- Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
- Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
- Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
- Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
- Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
- Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).
- Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
- Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
- Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
- MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
- Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Research. 42 (17), 131 (2014).
- Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
- Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
- Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
- Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
- Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans. FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).
- Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
- Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
- O’Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
- Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D298-D299 (2015).
- Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).
