Métodos para Confirmação de Eletroporação e Transformação em Limosilactobacillus reuteri DSM20016
Summary
Aqui, apresentamos protocolos para trabalhar com Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detalhando crescimento, transformação plasmidial, PCR de colônias, medição de proteína repórter fluorescente e mini-preparação limitada de plasmídeos, bem como problemas comuns e solução de problemas. Esses protocolos permitem a medição de proteínas repórteres em DSM20016, ou a confirmação via PCR de colônia se nenhum repórter estiver envolvido.
Abstract
Lactobacillus eram um gênero incrivelmente grande e diversificado de bactérias compreendendo 261 espécies, várias das quais eram cepas comensais com potencial para uso como chassi para empreendimentos biológicos sintéticos dentro do trato gastrointestinal. A ampla variação fenotípica e genotípica observada dentro do gênero levou a uma recente reclassificação e à introdução de 23 novos gêneros.
Devido à amplitude das variações dentro dos gêneros antigos, os protocolos demonstrados em um membro podem não funcionar como anunciado com outros membros. A falta de informações centralizadas sobre como manipular exatamente cepas específicas levou a uma série de abordagens ad hoc , muitas vezes adaptadas de outras famílias bacterianas. Isso pode complicar as coisas para os pesquisadores que estão começando na área, que podem não saber quais informações se aplicam ou não à cepa escolhida.
Neste artigo, pretendemos centralizar um conjunto de protocolos com sucesso demonstrado, especificamente na designação F275 da cepa de Limosilactobacillus reuteri (outros números de coleta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), juntamente com conselhos de solução de problemas e problemas comuns que se podem encontrar. Esses protocolos devem permitir que um pesquisador com pouca ou nenhuma experiência trabalhando com DSM20016 de L. reuteri transforme um plasmídeo, confirme a transformação e meça o feedback do sistema em um leitor de placas por meio de uma proteína repórter.
Introduction
O gênero Lactobacillus foi historicamente classificado como gram-positivo, em forma de bastonete, não formador de esporos, anaeróbios facultativos ou microaerófilos que quebram açúcares para produzir principalmente ácido lático1. Esses critérios frouxos levaram a que Lactobacillus fosse, fenotípica e genotipicamente, um gênero extremamente diverso. Essa ampla categorização resultou na reclassificação do gênero, introduzindo 23 novos gêneros em 20202.
O gênero antigo e mais amplo incluía as principais espécies comensais e probióticas geralmente consideradas seguras (GRAS) para consumo3. A família Lactobacillaceae mantém uma percepção pública de serem “bactérias boas” devido aos muitos benefícios relatados à saúde conferidos pelo consumo de várias cepas 4,5,6,7. A facilidade com que eles podem navegar no trato gastrointestinal8 e sua aceitação pública combinam-se para posicionar cepas de Lactobacillaceae como fortes candidatas como organismos de chassi para aplicações medicinais, terapêuticas ou diagnósticas ingeríveis.
A ampla gama de características presentes na família Lactobacillaceae levou a uma situação em que não há de fato uma cepa de organismo-modelo; Os grupos de pesquisa tendem a selecionar espécies com as propriedades mais relevantes para seus objetivos particulares. (Por exemplo, laboratórios de fermentação láctea poderiam escolher L. lactis; estudos de fermentação vegetal poderiam selecionar L. plantarum; pesquisas sobre probióticos poderiam se concentrar em L. acidophilus; e assim por diante.)
Essa mesma ampla gama de características entre as espécies levou a um acúmulo de protocolos e procedimentos que podem funcionar bem para um subconjunto da família Lactobacillaceae , mas requerem otimização para funcionar eficientemente (ou talvez para funcionar) em outros9. Essa necessidade de otimização entre membros da família e mesmo dentro de membros da mesma espécie pode frustrar os esforços de pesquisadores desconhecidos. Os protocolos publicados nas seções de métodos dos artigos também podem incluir suas própriasmodificações10, levando a coleções de protocolos fragmentadas e descentralizadas.
L. reuteri é considerado um comensal amplamente vertebrado, encontrado consistentemente nos tratos gastrointestinal (GI) de mamíferos, aves11 e peixes12. As subcepas de L. reuteri são frequentemente geneticamente especializadas, via adaptação de proteínas de adesão do muco, para colonizar mais permanentemente hospedeiros nativos específicos 8,11,13. As espécies de Limosilactobacillus do trato gastrointestinal podem ser isoladas em hospedeiros fora de seu hospedeiro nativo, mas tendem mais para uma natureza transitória8.
Devido à especialização humano-hospedeiro, o L. reuteri DSM20016 posiciona-se muito bem como um chassi para aplicações diagnósticas ou terapêuticas em qualquer ponto do trato gastrointestinal humano, e a tensão DSM20016 poderia fornecer uma janela de efeito mais duradoura para intervenções quando comparada a cepas mais transitórias.
Neste artigo, descrevemos uma série de protocolos com eficácia demonstrada em Limosilactobacillus reuteri (designação da cepa: F275; outros números de coleta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), juntamente com informações centralizadas sobre a cepa de outras fontes para auxiliar em aplicações de biologia molecular e de sistemas. Os procedimentos aqui descritos devem permitir que um pesquisador sem experiência prévia em cultura de L. reuteri, crie estoques eletrocompetentes, selecione colônias transformadas, confirme a transformação via reação em cadeia da polimerase (PCR) de colônias e meça a resposta do sistema projetado via proteínas fluorescentes repórteres.
Observamos que protocolos relacionados cobriram a recombinação do genoma assistida por CRISPR-Cas9 em L. reuteri (cepa: ATCC-PTA-6475)14 e a edição do genoma assistida por nickase CRSIPR-Cas9 em múltiplas colorações não-L. reuteri, da família Lactobacillaceae 15,16; estes, no entanto, não abordam a cepa L. reuteri DSM20016 que é nosso foco aqui.
Protocol
Representative Results
Discussion
A etapa mais crítica para a transformação da DSM20016 de L. reuteri é a geração de condições de crescimento anaeróbio após as transformações serem plaqueadas; colônias adquiridas em condições aeróbicas são muito ocasionais e geralmente não crescem quando inoculadas em caldo MRS. O chapeamento de todo o volume de recuperação também deve ser praticado para maximizar a probabilidade de crescimento da colônia. Mesmo com essas duas etapas críticas, a eficiência da transformação ainda é uma …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos imensamente os valiosos conselhos fornecidos pelo Prof. J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), cuja orientação sobre o trabalho com L. reuteri ATCC PTA 6475 forneceu uma base para os métodos descritos aqui.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
Riferimenti
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