Methoden zur Elektroporation und Transformationsbestätigung in Limosilactobacillus reuteri DSM20016
Summary
Hier stellen wir Protokolle für die Arbeit mit Limosilactobacillus reuteri DSM20016 vor, die das Wachstum, die Plasmidtransformation, die Kolonie-PCR, die fluoreszierende Reporterproteinmessung und die begrenzte Plasmid-Minivorbereitung detailliert beschreiben, sowie häufige Probleme und Fehlerbehebung. Diese Protokolle ermöglichen die Messung von Reporterproteinen in DSM20016 oder die Bestätigung durch Kolonie-PCR, wenn kein Reporter beteiligt ist.
Abstract
Lactobacillus waren eine unglaublich große, vielfältige Bakteriengattung mit 261 Arten, von denen einige kommensale Stämme waren, die das Potenzial hatten, als Chassis für synthetische biologische Unternehmungen im Magen-Darm-Trakt verwendet zu werden. Die große phänotypische und genotypische Variation, die innerhalb der Gattung beobachtet wurde, führte zu einer kürzlichen Neuklassifizierung und der Einführung von 23 neuen Gattungen.
Aufgrund der Breite der Variationen innerhalb der alten Gattungen kann es vorkommen, dass Protokolle, die in einem Mitglied nachgewiesen wurden, bei anderen Mitgliedern nicht so funktionieren, wie es angekündigt wurde. Der Mangel an zentralisierten Informationen darüber, wie bestimmte Stämme genau manipuliert werden können, hat zu einer Reihe von Ad-hoc-Ansätzen geführt, die oft von anderen Bakterienfamilien übernommen wurden. Dies kann die Sache für Forscher, die auf diesem Gebiet beginnen, erschweren, da sie möglicherweise nicht wissen, welche Informationen auf die von ihnen gewählte Sorte zutreffen und welche nicht.
In diesem Artikel wollen wir eine Reihe von Protokollen mit nachgewiesenem Erfolg zentralisieren, insbesondere in der Limosilactobacillus reuteri-Stammbezeichnung F275 (andere Sammlungsnummern: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), zusammen mit Ratschlägen zur Fehlerbehebung und häufigen Problemen, auf die man stoßen kann. Diese Protokolle sollten es einem Forscher mit wenig bis gar keiner Erfahrung in der Arbeit mit L. reuteri DSM20016 ermöglichen, ein Plasmid zu transformieren, die Transformation zu bestätigen und die Systemrückkopplung in einem Plattenleser über ein Reporterprotein zu messen.
Introduction
Die Gattung Lactobacillus wurde historisch als grampositive, stäbchenförmige, nicht sporenbildende Anaerobier oder Mikroaerophile klassifiziert, die Zucker abbauen, um hauptsächlich Milchsäure zu produzieren1. Diese lockeren Kriterien führten dazu, dass Lactobacillus phänotypisch und genotypisch eine äußerst vielfältige Gattung ist. Diese breite Kategorisierung führte dazu, dass die Gattung neu klassifiziert wurde und im Jahr 2020 23 neue Gattungen eingeführt wurden2.
Die alte, breitere Gattung umfasste wichtige kommensale und probiotische Arten, die allgemein als sicher für den Verzehr angesehen werden (GRAS)3. Die Familie der Lactobacillaceae wird in der Öffentlichkeit aufgrund vieler berichteter gesundheitlicher Vorteile, die durch den Verzehrverschiedener Stämme erzielt werden, als “gute Bakterien” wahrgenommen 4,5,6,7. Die Leichtigkeit, mit der sie sich im Magen-Darm-Trakt zurechtfinden 8, und ihre öffentliche Akzeptanz machen Lactobacillaceae-Stämme zu starken Kandidaten als Chassis-Organismen für einnehmbare medizinische, therapeutische oder diagnostische Anwendungen.
Das breite Spektrum an Merkmalen, die innerhalb der Familie der Lactobacillaceae vorhanden sind, hat zu einer Situation geführt, in der es de facto keinen Modellorganismusstamm gibt; Forschungsgruppen tendieren dazu, Arten mit den Eigenschaften auszuwählen, die für ihre jeweiligen Ziele am relevantesten sind. (Zum Beispiel könnten Milchfermentationslabore L. lactis auswählen; Studien zur pflanzlichen Fermentation könnten L. plantarum auswählen; die Forschung an Probiotika könnte sich auf L. acidophilus konzentrieren; und so weiter.)
Dieselbe breite Palette von Merkmalen über alle Arten hinweg hat zu einer Anhäufung von Protokollen und Verfahren geführt, die für eine Untergruppe der Lactobacillaceae-Familie gut funktionieren können, aber bei anderen optimiert werden müssen, um effizient zu funktionieren (oder vielleicht überhaupt zu funktionieren)9. Dieser Optimierungsbedarf zwischen Familienmitgliedern und sogar innerhalb von Mitgliedern derselben Art kann die Bemühungen unbekannter Forscher vereiteln. Protokolle, die in den Methodenabschnitten von Artikeln veröffentlicht werden, können auch ihre eigenen Modifikationen10 enthalten, was zu fragmentierten, dezentralen Protokollsammlungen führt.
L. reuteri gilt als weit verbreiteter Wirbeltier-Kommensal, der durchweg im Magen-Darm-Trakt von Säugetieren, Vögeln11 und Fischen12 vorkommt. L. reuteri-Unterstämme sind oft genetisch spezialisiert, indem sie sich an Schleimadhäsionsproteine anpassen, um bestimmte einheimische Wirte dauerhafter zu besiedeln 8,11,13. Limosilactobacillus-Arten aus dem Magen-Darm-Trakt können in Wirten außerhalb ihres heimischen Wirts isoliert werden, tendieren aber eher zu einer vorübergehenden Natur8.
Aufgrund der Spezialisierung von Mensch und Wirt positioniert sich L. reuteri DSM20016 sehr gut als Chassis für diagnostische oder therapeutische Anwendungen an jedem Punkt des menschlichen Magen-Darm-Trakts, und der Stamm DSM20016 könnte im Vergleich zu transitorischen Stämmen ein länger anhaltendes Wirkungsfenster für Interventionen bieten.
In diesem Artikel skizzieren wir eine Reihe von Protokollen mit nachgewiesener Wirksamkeit bei Limosilactobacillus reuteri (Stammbezeichnung: F275; andere Sammlungsnummern: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), zusammen mit zentralisierten Informationen über den Stamm aus anderen Quellen, um molekular- und systembiologische Anwendungen zu unterstützen. Die hier beschriebenen Verfahren sollten es einem Forscher ohne vorherige Erfahrung ermöglichen, L. reuteri zu kultivieren, elektrokompetente Bestände zu schaffen, transformierte Kolonien auszuwählen, die Transformation durch die Koloniepolymerase-Kettenreaktion (PCR) zu bestätigen und die geplante Systemantwort über fluoreszierende Reporterproteine zu messen.
Wir stellen fest, dass verwandte Protokolle die CRISPR-Cas9-unterstützte ssDNA-Genom-Rekombinierung in L. reuteri (Stamm: ATCC-PTA-6475)14 und die CRSIPR-Cas9-Nickase-unterstützte Genomeditierung in mehreren nicht-L. reuteri, Lactobacillaceae-Familienfärbungen 15,16; Diese befassen sich jedoch nicht mit dem Stamm L. reuteri DSM20016, auf den wir uns hier konzentrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der kritischste Schritt für die Transformation von L. reuteri DSM20016 ist die Erzeugung von anaeroben Wachstumsbedingungen nach der Transformation; Kolonien, die unter aeroben Bedingungen gewonnen werden, sind nur sehr selten und wachsen im Allgemeinen nicht, wenn sie in MRS-Brühe geimpft werden. Die Beschichtung des gesamten Erholungsvolumens sollte ebenfalls geübt werden, um die Wahrscheinlichkeit des Koloniewachstums zu maximieren. Selbst mit diesen beiden kritischen Schritten ist die Transformationseffiz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir schätzen die wertvolle Beratung durch Prof. J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), dessen Anleitung zur Arbeit mit L. reuteri ATCC PTA 6475 eine Grundlage für die hier beschriebenen Methoden bildete.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
Riferimenti
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