लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी में इलेक्ट्रोपोरेशन और ट्रांसफॉर्मेशन कन्फर्मेशन के तरीके DSM20016
Summary
यहां, हम लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी DSM20016 के साथ काम करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, विकास, प्लास्मिड परिवर्तन, कॉलोनी पीसीआर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन माप, और सीमित प्लास्मिड मिनी-प्रेप, साथ ही साथ सामान्य मुद्दों और समस्या निवारण का विवरण देते हैं। ये प्रोटोकॉल DSM20016 में रिपोर्टर प्रोटीन के माप, या कॉलोनी पीसीआर के माध्यम से पुष्टि करने की अनुमति देते हैं यदि कोई रिपोर्टर शामिल नहीं है।
Abstract
लैक्टोबैसिलस बैक्टीरिया का एक अविश्वसनीय रूप से बड़ा, विविध जीनस था जिसमें 261 प्रजातियां शामिल थीं, जिनमें से कई गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के भीतर सिंथेटिक जैविक प्रयासों के लिए चेसिस के रूप में उपयोग की क्षमता के साथ कॉमेंसल उपभेद थे। जीनस के भीतर देखे गए व्यापक फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक भिन्नता ने हाल ही में पुनर्वर्गीकरण और 23 उपन्यास जेनेरा की शुरूआत की।
पुराने जेनेरा के भीतर भिन्नताओं की चौड़ाई के कारण, एक सदस्य में प्रदर्शित प्रोटोकॉल अन्य सदस्यों के साथ विज्ञापित के रूप में काम नहीं कर सकते हैं। विशिष्ट उपभेदों में हेरफेर करने के तरीके पर केंद्रीकृत जानकारी की कमी ने तदर्थ दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला को जन्म दिया है, जो अक्सर अन्य जीवाणु परिवारों से अनुकूलित होते हैं। यह क्षेत्र में शुरू होने वाले शोधकर्ताओं के लिए मामलों को जटिल कर सकता है, जो यह नहीं जान सकते हैं कि कौन सी जानकारी उनके चुने हुए तनाव पर लागू होती है या नहीं।
इस पेपर में, हम प्रदर्शित सफलता के साथ प्रोटोकॉल के एक सेट को केंद्रीकृत करने का लक्ष्य रखते हैं, विशेष रूप से लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी स्ट्रेन पदनाम एफ 275 (अन्य संग्रह संख्या: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), समस्या निवारण सलाह और सामान्य मुद्दों के साथ। इन प्रोटोकॉल को एक शोधकर्ता को एक प्लास्मिड को बदलने, परिवर्तन की पुष्टि करने और रिपोर्टर प्रोटीन के माध्यम से प्लेट रीडर में सिस्टम प्रतिक्रिया को मापने के लिए एल रियूटेरी DSM20016 के साथ काम करने का बहुत कम अनुभव होना चाहिए।
Introduction
जीनस लैक्टोबैसिलस को ऐतिहासिक रूप से ग्राम-पॉजिटिव, रॉड के आकार के, गैर-बीजाणु बनाने वाले के रूप में वर्गीकृत किया गया था, या तो संकाय एनारोबेस या माइक्रोएरोफाइल जो मुख्य रूप से लैक्टिक एसिड1 का उत्पादन करने के लिए शर्करा को तोड़ते हैं। इन ढीले मानदंडों ने लैक्टोबैसिलस , फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक रूप से, एक अत्यंत विविध जीनस होने का नेतृत्व किया। इस व्यापक वर्गीकरण के परिणामस्वरूप जीनस को फिर से वर्गीकृत किया गया, 20202 में 23 उपन्यास जेनेरा पेश किए गए।
पुराने, व्यापक जीनस में प्रमुख कॉमेंसल और प्रोबायोटिक प्रजातियां शामिल थीं जिन्हें आम तौरपर खपत के लिए सुरक्षित (जीआरएएस) माना जाता था। लैक्टोबैसिलेसी परिवारविभिन्न उपभेदों 4,5,6,7 के सेवन के माध्यम से दिए गए कई स्वास्थ्य लाभों के कारण ‘अच्छे बैक्टीरिया’ होने की सार्वजनिक धारणा बनाए रखता है। जिस आसानी से वे जठरांत्र संबंधी मार्ग8 और उनकी सार्वजनिक स्वीकृति को नेविगेट कर सकते हैं, वह लैक्टोबैसिलेसी उपभेदों को चेसिस जीवों के रूप में मजबूत उम्मीदवारों के रूप में स्थापित करने के लिए गठबंधन करता है।
लैक्टोबैसिलेसी परिवार के भीतर मौजूद विशेषताओं की विस्तृत श्रृंखला ने एक ऐसी स्थिति को जन्म दिया है जिसमें कोई वास्तविक मॉडल-जीव तनाव नहीं है; अनुसंधान समूहों ने अपने विशेष उद्देश्यों के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक गुणों के साथ प्रजातियों का चयन करने का प्रयास किया है। (उदाहरण के लिए, डेयरी किण्वन प्रयोगशालाएं एल लैक्टिस चुन सकती हैं; सब्जी किण्वन के अध्ययन एल प्लांटरम का चयन कर सकते हैं; प्रोबायोटिक्स पर शोध एल एसिडोफिलस पर ध्यान केंद्रित कर सकता है; और इसी तरह।
प्रजातियों में विशेषताओं की इस एक ही विस्तृत श्रृंखला ने प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं के संचय को जन्म दिया है जो लैक्टोबैसिलेसी परिवार के एक उप-समूह के लिए अच्छी तरह से काम कर सकते हैं,लेकिन दूसरों में कुशलता से काम करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है (या शायद बिल्कुल भी कार्य करने के लिए)। परिवार के सदस्यों के बीच और यहां तक कि एक ही प्रजाति के सदस्यों के भीतर अनुकूलन की यह आवश्यकता अपरिचित शोधकर्ताओं के प्रयासों को निराश कर सकती है। कागजात के विधि अनुभागों में प्रकाशित प्रोटोकॉल में उनके स्वयं के संशोधनभी शामिल हो सकते हैं, जिससे खंडित, विकेन्द्रीकृत प्रोटोकॉल संग्रह हो सकते हैं।
रेउटेरी को एक व्यापक रूप से कशेरुक ी कमेंसल माना जाता है, जो स्तनधारी, एवियन11 और मछली12 गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) ट्रैक्ट में लगातार पाया जाता है। रेयूटेरी उप-उपभेदों को अक्सर आनुवंशिक रूप से विशिष्ट किया जाता है, बलगम आसंजन प्रोटीन अनुकूलन के माध्यम से, विशिष्टमूल मेजबानों को अधिक स्थायी रूप से उपनिवेशित करने के लिए 8,11,13। जीआई पथ लिमोसिलेक्टोबैसिलस प्रजातियों को उनके मूल मेजबान के बाहर मेजबानों में अलग किया जा सकता है, लेकिन क्षणिक प्रकृतिकी ओर अधिक होता है।
मानव-मेजबान विशेषज्ञता के कारण, एल रेयूटेरी DSM20016 मानव जीआई पथ में किसी भी बिंदु पर नैदानिक या चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए चेसिस के रूप में खुद को बहुत अच्छी तरह से रखता है, और तनाव DSM20016 अधिक क्षणभंगुर उपभेदों की तुलना में हस्तक्षेप के लिए प्रभाव की एक लंबी खिड़की प्रदान कर सकता है।
इस पेपर में, हम आणविक और सिस्टम जीव विज्ञान अनुप्रयोगों में सहायता के लिए अन्य स्रोतों से तनाव पर केंद्रीकृत जानकारी के साथ-साथ लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी (तनाव पदनाम: एफ 275; अन्य संग्रह संख्या: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) में प्रदर्शित प्रभावशीलता के साथ प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला को रेखांकित करते हैं। यहां निर्धारित प्रक्रियाओं को एक शोधकर्ता को एल रियूटेरी को कल्चर करने, इलेक्ट्रोसक्षम स्टॉक बनाने, रूपांतरित कॉलोनियों का चयन करने, कॉलोनी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के माध्यम से परिवर्तन की पुष्टि करने और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के माध्यम से डिज़ाइन की गई सिस्टम प्रतिक्रिया को मापने में सक्षम बनाना चाहिए।
हम ध्यान दें कि संबंधित प्रोटोकॉल ने सीआरआईएसपीआर-कैस 9 सहायता प्राप्त एसएसडीएनए जीनोम रीकंबाइनिंग को एल रियूटेरी (स्ट्रेन: एटीसीसी-पीटीए-6475)14 में कवर किया है, और सीआरएसआईपीआर-कैस 9 निकस-असिस्टेड जीनोम एडिटिंग में कई गैर-एल में शामिल हैं। हालांकि, ये एल रियूटेरी DSM20016 तनाव को संबोधित नहीं करते हैं जो यहां हमारा ध्यान केंद्रित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
रियूटेरी DSM20016 के परिवर्तन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम परिवर्तनों को चढ़ाने के बाद एनारोबिक विकास स्थितियों की पीढ़ी है; एरोबिक स्थितियों में प्राप्त कॉलोनियां केवल बहुत सामयिक होती हैं और आमतौर पर ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वैन पिजकेरेन (विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गई मूल्यवान सलाह की बहुत सराहना करते हैं, जिनके मार्गदर्शन में एल रेउटेरी एटीसीसी पीटीए 6475 के साथ काम करने पर यहां वर्णित तरीकों के लिए एक आधार प्रदान किया गया है।
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
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