Plattform zum quantitativen Nachweis von Immunzellen des Endometriums auf Basis von Immunhistochemie und digitaler Bildanalyse

Summary

Hier wurde eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform entwickelt und validiert, um die Immunzellen des Endometriums von Patientinnen mit rezidivierenden Fehlgeburten im Implantationsfenster quantitativ zu analysieren.

Abstract

Um die Immunumgebung des Endometriums von Patientinnen mit rezidivierenden Fehlgeburten (RM) zu bewerten, wurde eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform entwickelt und validiert, um Immunzellen des Endometriums während der mittleren Lutealphase quantitativ zu analysieren. Alle Proben der Gebärmutterschleimhaut wurden während der mittleren Lutealphase des Menstruationszyklus entnommen. In Paraffin eingebettetes Endometriumgewebe wurde in 4 μm dicke Objektträger geschnitten und eine immunhistochemische (IHC) Färbung zum Nachweis von Immunzellen des Endometriums, einschließlich CD56+ uNK-Zellen, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2-Makrophagen, CD1a+ DCs und CD8+ T-Zellen, durchgeführt. Die Panorama-Dias wurden mit einem digitalen Diascanner gescannt und für die quantitative Analyse wurde ein kommerzielles Bildanalysesystem verwendet. Der prozentuale Anteil der Immunzellen des Endometriums wurde berechnet, indem die Anzahl der Immunzellen in den gesamten Endometriumzellen geteilt wurde. Mit dem kommerziellen Bildanalysesystem konnte die quantitative Bewertung von Immunzellen des Endometriums, die mit herkömmlicher Bildanalyse nur schwer oder gar nicht analysiert werden können, einfach und genau analysiert werden. Diese Methodik kann angewendet werden, um die Mikroumgebung der Gebärmutterschleimhaut, einschließlich der Interaktion zwischen Immunzellen, und ihre Heterogenität für verschiedene Patientinnen mit reproduktivem Versagen quantitativ zu charakterisieren. Die Plattform zur quantitativen Bewertung von Immunzellen des Endometriums könnte für die Diagnose und Behandlung von RM-Patientinnen von wichtiger klinischer Bedeutung sein.

Introduction

Wiederholte Fehlgeburten (RM) sind der Verlust von zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Schwangerschaften und sind eine komplexe Erkrankung, die in den letzten Jahren die Aufmerksamkeit von Klinikern auf sich gezogen hat. Die Inzidenzrate von RM bei Frauen im gebärfähigen Alter liegt bei 1%-5% ¹. Ergebnisse früherer Studien zeigen, dass Immunfaktoren eng mit der Pathogenese von RM 2,3,4,5 assoziiert sind. Die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase an der Schnittstelle zwischen Mutter und Fötus ist für die Einnistung und Entwicklung des Embryos erforderlich. Endometrium-Immunzellen erfüllen mehrere regulatorische Funktionen, um diese Homöostase aufrechtzuerhalten, wie z. B. die Förderung der Trophoblasteninvasion, den Umbau von Spiralarterien und die Mitwirkung an der Plazentaentwicklung 6,7,8,9.

Zuvor wurde über aberrante Immunzellen des Endometriums bei Frauen mit RM berichtet. Die Ergebnisse zeigen einen engen Zusammenhang zwischen der hohen Dichte an uterinen natürlichen Killerzellen (uNKs) und dem Auftreten von RM^10,11,12. Eine erhöhte Anzahl von Makrophagen wurde im Endometrium von Frauen mit RM im Vergleich zu Frauen mit Lebendgeburt berichtet¹³. Regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine Rolle bei der mütterlichen Immuntoleranz gegenüber dem Embryo, und ihr Spiegel und ihre Funktion sind in der Dezidua von RM-Patienten verringert¹⁴. Zytotoxizität T-Zellen (CTL) und dendritische Zellen (DCs) spielen ebenfalls eine Rolle bei der Immunregulation der Schwangerschaft^15,16. Daher könnte eine umfassende quantitative Analyse lokaler Immunzellen des Endometriums während der mittleren Lutealphase helfen, die Pathogenese der RM besser zu verstehen. Einige aktuelle Methoden zur quantitativen Analyse von Immunzellen des Endometriums verwenden die Durchflusszytometrie, die Immunzellen mit mehreren Markern genau markieren kann^17,18. Die klinische Anwendung der Durchflusszytometrie ist jedoch begrenzt, da sie nur an frischem Gewebe durchgeführt werden kann. Die Gewinnung von frischem Gewebe ist nur möglich, wenn ein großes Volumen an überschüssigem Tumor zur Verfügung steht, was bei der Gebärmutterschleimhaut selten vorkommt. Die Immunhistochemie kann die Gewebemorphologie gut in situ beobachten und auch verschiedene Immunzellen markieren, während herkömmliche immunhistochemische Techniken keine quantitative Analyse von Immunzellen durchführen können.

Im Vergleich zu konventionellen immunhistochemischen Experimenten hat die quantitative immunhistochemische Analyse von Immunzellen im Endometrium eine wichtige klinische Bedeutung. Das IHC-Intensitäts-Scoring wird in der Regel auf einer vierstufigen Skala oder stark und schwach in der pathologischen Diagnostik und Forschung eingestuft 19,20,21. Diese semi-quantitative Technik ist jedoch subjektiv, höchst ungenau und weist eine signifikante Variabilität innerhalb und zwischen Beobachtern auf²². Eine mögliche Lösung ist die Anwendung des maschinellen Lernens, das in der digitalen Bildanalyse wertvoll ist^23,24. Durch quantitative Messungen ermöglicht dieser Ansatz eine genauere Beurteilung der Infiltration, Verteilung und Dichte von Immunzellen im Gebärmuttergewebe. Diese quantitativen Informationen können dazu beitragen, die dynamischen Veränderungen in Immunzellpopulationen während des Menstruationszyklus und bei verschiedenen pathologischen Zuständen aufzuklären. Insgesamt bietet die Möglichkeit, Immunzellen in der Gebärmutterschleimhaut mittels Immunhistochemie quantitativ zu analysieren, wertvolle Einblicke in die Immunmikroumgebung der Gebärmutter.

Daher zielte das Protokoll darauf ab, eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform zu entwickeln und zu validieren, um Immunzellen des Endometriums, einschließlich uNK-Zellen, Tregs, Makrophagen, DCs und zytotoxischer T-Zellen, während der mittleren Lutealphase bei RM-Patienten quantitativ zu analysieren.

Protocol

Der Forschungsinhalt und das Protokoll wurden von der Forschungsethikkommission des Shenzhen Zhongshan Urology Hospital ethisch geprüft und genehmigt. Alle Frauen (20 bis 40 Jahre), die an der Studie teilnahmen, gaben eine informierte Einwilligung für die Probenentnahme und -verwendung. 1. Gewinnung von pathologischem Gewebe Bereiten Sie die Werkzeuge für die Gewebeentnahme vor, nämlich Messlineal, Pinzette, Einbettkassette, Einbettpapier und Taschentuchkorb.</li…

Representative Results

Um endometriale Immunzellen quantitativ zu bewerten und die durch vom Menschen verursachte Instabilität zu reduzieren, haben wir eine digitale quantitative Analyseplattform für Endometrium-Immunzellen etabliert, indem wir einen automatischen immunhistochemischen Nachweis und ein digitales quantitatives Auswertungssystem verwenden. Eine immunhistochemische Bildanalyseplattform wurde etabliert, um Immunzellen des Endometriums von Patientinnen mit wiederholten Fehlgeburten (RM) im Implantationsfenster quantitativ zu analy…

Discussion

Mit diesem Protokoll wurde eine digitale immunhistochemische Bildanalyseplattform zur quantitativen Analyse von Immunzellen des Endometriums von RM-Patientinnen etabliert. Hier wurden sechs Endometrium-Immunmarker detektiert, um die Mikroumgebung des Endometriumimmuns bei RM-Patientinnen zu bewerten.

Ein rezeptives Endometrium während der mittleren Lutealphase ist der Schlüssel für eine erfolgreiche Einnistung und Schwangerschaft^27,28</su…

Materials

Automated coverslipper	Sakuraus	DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163	GrowGn Biotechnology	NCL-L-CD163
CD1a	Gene Tech	GM357129
CD56	Gene Tech	GT200529
CD8	Novocastra	NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator	Thermo Fisher	Excelsior ES
Digital pathology and	Indica labs	HALO
Foxp3	YILIFANG biological	14-477-82
IHC stainer	Leica	BOND III
Image analysis platform	Indica labs	HALO
Slide Scanner	Olympus life science	VS200