Generazione di modelli di lesioni retiniche nei girini di Xenopus
Summary
Abbiamo sviluppato diversi protocolli per indurre danni o degenerazioni retiniche nei girini di Xenopus laevis . Questi modelli offrono la possibilità di studiare i meccanismi di rigenerazione retinica.
Abstract
Le malattie neurodegenerative della retina sono le principali cause di cecità. Tra le numerose strategie terapeutiche esplorate, l’autoriparazione stimolante è emersa recentemente come particolarmente attraente. Una fonte cellulare di interesse per la riparazione della retina è la cellula gliale di Müller, che ospita un potenziale di cellule staminali e una straordinaria capacità rigenerativa negli anamnioti. Questo potenziale è, tuttavia, molto limitato nei mammiferi. Lo studio dei meccanismi molecolari alla base della rigenerazione retinica in modelli animali con capacità rigenerative dovrebbe fornire informazioni su come sbloccare la capacità latente delle cellule di Müller dei mammiferi di rigenerare la retina. Si tratta di un passo fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa. A questo scopo, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di danno retinico in Xenopus: una lesione retinica meccanica, una linea transgenica che consente l’ablazione condizionale dei fotorecettori mediata dalla nitroreduttasi, un modello di retinite pigmentosa basato sul knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9 e un modello citotossico guidato da iniezioni intraoculari di CoCl2 . Evidenziandone i vantaggi e gli svantaggi, descriviamo qui questa serie di protocolli che generano varie condizioni degenerative e permettono lo studio della rigenerazione retinica in Xenopus.
Introduction
Milioni di persone in tutto il mondo sono afflitte da varie malattie degenerative della retina che portano alla cecità, come la retinite pigmentosa, la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all’età (AMD). Ad oggi, queste condizioni rimangono in gran parte incurabili. Gli attuali approcci terapeutici in fase di valutazione includono la terapia genica, i trapianti di cellule o tessuti, i trattamenti neuroprotettivi, l’optogenetica e i dispositivi protesici. Un’altra strategia emergente si basa sull’auto-rigenerazione attraverso l’attivazione di cellule endogene con potenziale di cellule staminali. Le cellule gliali di Müller, il principale tipo di cellule gliali della retina, sono tra le fonti cellulari di interesse in questo contesto. In caso di lesione, possono dedifferenziarsi, proliferare e generare neuroni 1,2,3. Sebbene questo processo sia molto efficace nel pesce zebra o nello Xenopus, è in gran parte inefficiente nei mammiferi.
Ciononostante, è stato dimostrato che trattamenti appropriati con proteine mitogeniche o sovraespressione di vari fattori possono indurre il rientro del ciclo cellulare della glia di Müller nei mammiferi e, in alcuni casi, innescare il loro successivo impegno di neurogenesi 1,2,3,4,5. Questo rimane, tuttavia, largamente insufficiente per i trattamenti. Pertanto, è necessario aumentare la nostra conoscenza dei meccanismi molecolari alla base della rigenerazione per identificare molecole in grado di trasformare in modo efficiente le proprietà delle cellule staminali di Müller in nuove strategie terapeutiche cellulari.
Con questo obiettivo, abbiamo sviluppato diversi paradigmi di lesione in Xenopus che innescano la degenerazione delle cellule retiniche. Qui, presentiamo (1) una lesione retinica meccanica che non è specifica per il tipo di cellula, (2) un modello di ablazione cellulare condizionale e reversibile che utilizza il sistema NTR-MTZ che prende di mira le cellule dei bastoncelli, (3) un knockout della rodopsina mediato da CRISPR/Cas9, un modello di retinite pigmentosa che innesca la degenerazione progressiva delle cellule dei bastoncelli e (4) un CoCl2-modello citotossico indotto che, a seconda della dose, può colpire in modo specifico i coni o portare a una più ampia degenerazione delle cellule retiniche. Evidenziamo le particolarità, i vantaggi e gli svantaggi di ciascun paradigma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vantaggi e svantaggi dei vari paradigmi di lesione retinica nei girini di Xenopus
Lesione meccanica della retina
Varie lesioni chirurgiche della retina neurale sono state sviluppate nei girini di Xenopus. La retina neurale può essere completamente rimossa 15,16 o asportata solo parzialmente16,17. La lesione meccanica qui p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni a M.P. da parte dell’Association Retina France, della Fondation de France, della FMR (Fondation Maladies Rares), della BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) e dell’UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in collaborazione con ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
Riferimenti
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