Summary

Xenopusオタマジャクシにおける網膜損傷モデルの生成

Published: October 13, 2023
doi:

Summary

私たちは、 Xenopus laevis オタマジャクシの網膜損傷または網膜変性を誘発するためのいくつかのプロトコルを開発しました。これらのモデルは、網膜再生メカニズムを研究する可能性を提供します。

Abstract

網膜神経変性疾患は失明の主な原因です。数多くの治療戦略が検討されている中で、最近、刺激的な自己修復が特に魅力的に浮上しています。網膜修復に関心のある細胞源はミュラーグリア細胞であり、幹細胞の可能性とアナムニオテスの並外れた再生能力を秘めています。しかし、この可能性は哺乳類では非常に限られています。再生能力を持つ動物モデルで網膜再生の根底にある分子メカニズムを研究することで、哺乳類ミュラー細胞の網膜再生能力を解き放つ方法についての洞察が得られるはずです。これは、再生医療における治療戦略の開発にとって重要なステップです。この目的のために、Xenopusでは、機械的網膜損傷、ニトロレダクターゼを介した光受容体条件付きアブレーションを可能にするトランスジェニックライン、CRISPR/Cas9を介したロドプシンノックアウトに基づく網膜色素変性症モデル、および眼内CoCl2注射によって駆動される細胞傷害モデルなど、いくつかの網膜損傷パラダイムを開発しました。それらの長所と短所を強調して、ここでは、さまざまな変性状態を生成し、Xenopusにおける網膜再生の研究を可能にするこの一連のプロトコルについて説明します。

Introduction

世界中の何百万人もの人々が、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)など、失明につながるさまざまな網膜変性疾患に苦しんでいます。今日まで、これらの状態はほとんど治療できないままです。現在評価されている治療法には、遺伝子治療、細胞または組織移植、神経保護治療、光遺伝学、補綴装置などがあります。もう一つの新たな戦略は、幹細胞の潜在能力を持つ内因性細胞の活性化による自己再生に基づいています。網膜の主要なグリア細胞型であるミュラーグリア細胞は、この文脈で関心のある細胞源の一つです。損傷を受けると、それらは脱分化、増殖、およびニューロンを生成することができます1,2,3。このプロセスはゼブラフィッシュやゼノプスでは非常に効果的ですが、哺乳類ではほとんど非効率的です。

それにもかかわらず、分裂促進タンパク質またはさまざまな要因の過剰発現による適切な処理は、哺乳類ミュラーグリア細胞周期の再突入を誘発し、場合によっては、その後の神経新生コミットメントを引き起こす可能性があることが示されています1,2,3,4,5。しかし、これは治療にはほとんど不十分なままです。したがって、再生の根底にある分子メカニズムに関する知識を深めることは、ミュラー幹様細胞の特性を新しい細胞治療戦略に効率的に変換できる分子を特定するために必要です。

この目的のために、私たちは網膜細胞の変性を引き起こすいくつかの傷害パラダイムを Xenopus で開発しました。ここでは、(1)細胞型に特異的ではない機械的網膜損傷、(2)桿体細胞を標的とするNTR-MTZシステムを用いた条件付きおよび可逆的細胞アブレーションモデル、(3)CRISPR/Cas9を介した ロドプシン ノックアウト、進行性桿体細胞変性を引き起こす網膜色素変性症のモデルおよび(4)CoCl2-用量に応じて、錐体を特異的に標的にしたり、より広範な網膜細胞変性を引き起こしたりできる誘導細胞傷害性モデル。各パラダイムの特殊性、長所、短所を強調します。

Protocol

動物の飼育と実験は、施設のライセンスA91272108の下で、施設のガイドラインに従って行われました。研究プロトコルは、施設動物管理委員会CEEA #59によって承認され、参照番号APAFIS #32589-2021072719047904 v4およびAPAFIS #21474-2019071210549691 v2の下でDirection Départementale de la Protection des Populationsによって承認されました。これらのプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬に関連する詳細?…

Representative Results

機械的網膜損傷プロトコルセクション1に記載されている機械的損傷を受けたオタマジャクシの網膜切片は、網膜病変が穿刺部位に限定されたまま、組織のすべての層を包含していることを示しています(図2A、B)。 NTR-MTZシステムを用いた条件付き桿体細胞アブレーションプロトコルセクション2に記載され?…

Discussion

Xenopusオタマジャクシにおけるさまざまな網膜損傷パラダイムの長所と短所

機械的網膜損傷
Xenopusオタマジャクシでは、神経網膜のさまざまな外科的損傷が開発されています。神経網膜は、完全に切除されるか15,16か、部分的にのみ切除されるかのどちらかである16,17<…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、ITMO NNP(Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie)/ AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé)と共同で、Association Retina France、Fondation de France、FMR(Fondation Maladies Rares)、BBS(Association du syndrome de Bardet-Biedl)、UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels)の助成金を受けて行われました。

Materials

1,2-Propanediol (propylène glycol) Sigma-Aldrich 398039
Absolute ethanol ≥99.8% VWR chemicals 20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) Cell signaling 9661S Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken) Aveslabs GFP-1020 Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5405 Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11005 Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit) Abcam Ab183951 Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11008 Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11012 Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5585 Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) Sigma-Aldrich MABN15 Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5407 Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) Promega G3250
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) Sigma-Aldrich B2883 Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5% VWR chemicals 20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.02382 Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) New England Biolabs M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 Warner Instruments (Harvard Apparatus) 30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) Sigma-Aldrich C8661 Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm VWR 631-1575
Dako REAL ab diluent  Agilent S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Electronic Rotary Microtome Thermo Scientific Microm HM 340E 
Eosin 1% aqueous RAL Diagnostics 312740
Fluorescein lysine dextran   Invitrogen Thermo Scientific D1822
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX 200
Gentamycin Euromedex EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory Diapath E0012 Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) RAL Diagnostics 320550
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
Human chorionic gonadotropin hormone MSD Animal Health Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) Sigma-Aldrich (SAFC) 1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich C7880 Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.05886
Metronidazole  Sigma-Aldrich (Supelco) M3761 Use at 10 mM
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) Sutter Instrument Co. Model P-97 Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent Millipore 345789
Mounting medium, Eukitt Chem-Lab CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade Epredia 3053835
Needle Agani 25 G x 5/8'' Terumo AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm Sefar 06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO Histolab 00403
Paraformaldehyde solution (32%) Electron Microscopy Sciences EM-15714-S Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Epredia 2219
Pestle VWR 431-0094
Petri Dish 100 mm Corning Gosselin SB93-101
Petri Dish 55 mm Corning Gosselin BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x Euromedex ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system Parker Instrumentation Products PicoSpritzer III
Pins  Fine Science Tools 26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) Sigma-Aldrich F4375 Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature sera 45475 (00720)
Scissors dissection Fine Science Tools 14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL Glass VS11171076FKA 
Slide warmer Kunz instruments HP-3
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) VWR chemicals 27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) VWR chemicals 28217-292
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL B-BRAUN 9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA) Integrated DNA Technologies 1072533
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator X-Cite  200DC
Xylene ≥98.5%  VWR chemicals 28975-325

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Parain, K., Donval, A., Chesneau, A., Lun, J. X., Borday, C., Perron, M. Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (200), e65771, doi:10.3791/65771 (2023).

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