Summary

Создание моделей повреждений сетчатки у головастиков Xenopus

Published: October 13, 2023
doi:

Summary

Мы разработали несколько протоколов для индуцирования повреждения или дегенерации сетчатки у головастиков Xenopus laevis . Эти модели дают возможность изучать механизмы регенерации сетчатки.

Abstract

Нейродегенеративные заболевания сетчатки являются основными причинами слепоты. Среди многочисленных терапевтических стратегий, которые изучаются, стимулирующее самовосстановление в последнее время стало особенно привлекательным. Клеточным источником, представляющим интерес для восстановления сетчатки, является глиальная клетка Мюллера, которая обладает потенциалом стволовых клеток и необычайной регенеративной способностью у анамнетов. Однако у млекопитающих этот потенциал очень ограничен. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе регенерации сетчатки на животных моделях с регенеративными способностями, должно дать представление о том, как разблокировать скрытую способность клеток Мюллера млекопитающих регенерировать сетчатку. Это ключевой шаг для разработки терапевтических стратегий в регенеративной медицине. С этой целью мы разработали несколько парадигм повреждения сетчатки в Xenopus: механическое повреждение сетчатки, трансгенная линия, позволяющая проводить условную абляцию фоторецепторов, опосредованную нитроредуктазой, модель пигментного ретинита, основанная на нокауте родопсина , опосредованного CRISPR/Cas9, и цитотоксическая модель, управляемая внутриглазными инъекциями CoCl2 . Выделяя их преимущества и недостатки, мы описываем здесь эту серию протоколов, которые порождают различные дегенеративные состояния и позволяют изучать регенерацию сетчатки у Xenopus.

Introduction

Миллионы людей во всем мире страдают от различных дегенеративных заболеваний сетчатки, приводящих к слепоте, таких как пигментный ретинит, диабетическая ретинопатия или возрастная макулярная дегенерация (ВМД). На сегодняшний день эти состояния остаются в значительной степени неизлечимыми. В настоящее время оцениваются терапевтические подходы, включающие генную терапию, трансплантацию клеток или тканей, нейропротекторное лечение, оптогенетику и протезы. Другая новая стратегия основана на саморегенерации путем активации эндогенных клеток с потенциалом стволовых клеток. Глиальные клетки Мюллера, основной тип глиальных клеток сетчатки, являются одним из клеточных источников, представляющих интерес в этом контексте. При травме они могут дедифференцироваться, размножаться и генерировать нейроны 1,2,3. Хотя этот процесс очень эффективен у рыбок данио или ксенопусов, он в значительной степени неэффективен у млекопитающих.

Тем не менее, было показано, что соответствующее лечение митогенными белками или гиперэкспрессией различных факторов может индуцировать повторный вход в клеточный цикл глии Мюллера у млекопитающих и, в некоторых случаях, вызвать их последующее участие в нейрогенезе 1,2,3,4,5. Тем не менее, этого остается в значительной степени недостаточно для лечения. Следовательно, расширение наших знаний о молекулярных механизмах, лежащих в основе регенерации, необходимо для выявления молекул, способных эффективно превращать свойства стволовых клеток Мюллера в новые клеточные терапевтические стратегии.

С этой целью мы разработали несколько парадигм повреждений у Xenopus , которые запускают дегенерацию клеток сетчатки. Здесь мы представляем (1) механическое повреждение сетчатки, которое не является специфичным для типа клетки, (2) условную и обратимую модель абляции клеток с использованием системы NTR-MTZ, которая нацелена на палочковые клетки, (3) CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут родопсина , модель пигментного ретинита, которая вызывает прогрессирующую дегенерацию палочек клеток, и (4) CoCl2-индуцированная цитотоксическая модель, которая в зависимости от дозы может специфически воздействовать на колбочки или приводить к более широкой дегенерации клеток сетчатки. Выделены особенности, преимущества и недостатки каждой парадигмы.

Protocol

Уход за животными и эксперименты проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами, в соответствии с институциональной лицензией A91272108. Протоколы исследования были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными CEEA #59 и получили разрешение от Direction D?…

Representative Results

Механическая травма сетчаткиСрезы сетчатки головастиков, подвергшиеся механической травме, описанной в разделе 1 протокола, показывают, что поражение сетчатки охватывает все слои ткани, оставаясь ограниченным местом прокола (рис. 2А,Б). <p class="jove_cont…

Discussion

Преимущества и недостатки различных парадигм повреждения сетчатки у головастиков Xenopus

Механическая травма сетчатки
У головастиков Xenopus развились различные хирургические повреждения нервной сетчатки. Нервная сетчатка может быть удалена л?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследование выполнено при поддержке грантов Ассоциации сетчатки Франции, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) и UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) в партнерстве с ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, Sciences Cognitives, Neneurologye, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Materials

1,2-Propanediol (propylène glycol) Sigma-Aldrich 398039
Absolute ethanol ≥99.8% VWR chemicals 20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) Cell signaling 9661S Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken) Aveslabs GFP-1020 Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5405 Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11005 Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit) Abcam Ab183951 Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11008 Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11012 Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5585 Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) Sigma-Aldrich MABN15 Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5407 Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) Promega G3250
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) Sigma-Aldrich B2883 Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5% VWR chemicals 20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.02382 Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) New England Biolabs M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 Warner Instruments (Harvard Apparatus) 30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) Sigma-Aldrich C8661 Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm VWR 631-1575
Dako REAL ab diluent  Agilent S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Electronic Rotary Microtome Thermo Scientific Microm HM 340E 
Eosin 1% aqueous RAL Diagnostics 312740
Fluorescein lysine dextran   Invitrogen Thermo Scientific D1822
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX 200
Gentamycin Euromedex EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory Diapath E0012 Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) RAL Diagnostics 320550
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
Human chorionic gonadotropin hormone MSD Animal Health Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) Sigma-Aldrich (SAFC) 1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich C7880 Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.05886
Metronidazole  Sigma-Aldrich (Supelco) M3761 Use at 10 mM
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) Sutter Instrument Co. Model P-97 Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent Millipore 345789
Mounting medium, Eukitt Chem-Lab CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade Epredia 3053835
Needle Agani 25 G x 5/8'' Terumo AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm Sefar 06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO Histolab 00403
Paraformaldehyde solution (32%) Electron Microscopy Sciences EM-15714-S Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Epredia 2219
Pestle VWR 431-0094
Petri Dish 100 mm Corning Gosselin SB93-101
Petri Dish 55 mm Corning Gosselin BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x Euromedex ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system Parker Instrumentation Products PicoSpritzer III
Pins  Fine Science Tools 26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) Sigma-Aldrich F4375 Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature sera 45475 (00720)
Scissors dissection Fine Science Tools 14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL Glass VS11171076FKA 
Slide warmer Kunz instruments HP-3
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) VWR chemicals 27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) VWR chemicals 28217-292
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL B-BRAUN 9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA) Integrated DNA Technologies 1072533
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator X-Cite  200DC
Xylene ≥98.5%  VWR chemicals 28975-325

Riferimenti

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Biologia dello sviluppo. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

Play Video

Citazione di questo articolo
Parain, K., Donval, A., Chesneau, A., Lun, J. X., Borday, C., Perron, M. Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (200), e65771, doi:10.3791/65771 (2023).

View Video