Summary

Modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes

Published: October 13, 2023
doi:

Summary

We hebben verschillende protocollen ontwikkeld om schade aan het netvlies of degeneratie van het netvlies te induceren bij kikkervisjes van Xenopus laevis . Deze modellen bieden de mogelijkheid om retinale regeneratiemechanismen te bestuderen.

Abstract

Retinale neurodegeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaken van blindheid. Van de vele therapeutische strategieën die worden onderzocht, is het stimuleren van zelfherstel onlangs bijzonder aantrekkelijk gebleken. Een cellulaire bron van belang voor herstel van het netvlies is de Müller-gliacel, die stamcelpotentieel en een buitengewoon regeneratief vermogen in anamniotes herbergt. Dit potentieel is echter zeer beperkt bij zoogdieren. Het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regeneratie van het netvlies in diermodellen met regeneratieve vermogens zou inzicht moeten geven in hoe het latente vermogen van Müller-cellen van zoogdieren om het netvlies te regenereren kan worden ontsloten. Dit is een belangrijke stap voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën in de regeneratieve geneeskunde. Om dit doel te bereiken, ontwikkelden we verschillende paradigma’s voor netvliesbeschadiging in Xenopus: een mechanisch netvliesletsel, een transgene lijn die nitroreductase-gemedieerde voorwaardelijke ablatie van fotoreceptoren mogelijk maakt, een retinitis pigmentosa-model op basis van CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out , en een cytotoxisch model aangedreven door intraoculaire CoCl2-injecties . Door hun voor- en nadelen te benadrukken, beschrijven we hier deze reeks protocollen die verschillende degeneratieve aandoeningen genereren en de studie van retinale regeneratie bij Xenopus mogelijk maken.

Introduction

Miljoenen mensen over de hele wereld lijden aan verschillende degeneratieve ziekten van het netvlies die leiden tot blindheid, zoals retinitis pigmentosa, diabetische retinopathie of leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD). Tot op heden blijven deze aandoeningen grotendeels onbehandelbaar. De huidige therapeutische benaderingen die worden geëvalueerd, omvatten gentherapie, cel- of weefseltransplantaties, neuroprotectieve behandelingen, optogenetica en protheses. Een andere opkomende strategie is gebaseerd op zelfregeneratie door de activering van endogene cellen met stamcelpotentieel. Müller-gliacellen, het belangrijkste gliaceltype van het netvlies, behoren tot de cellulaire bronnen die in deze context van belang zijn. Bij letsel kunnen ze dedifferentiëren, prolifereren en neuronen genereren 1,2,3. Hoewel dit proces zeer effectief is bij zebravissen of Xenopus, is het grotendeels inefficiënt bij zoogdieren.

Desalniettemin is aangetoond dat geschikte behandelingen met mitogene eiwitten of overexpressie van verschillende factoren de terugkeer van de Müller-gliacelcyclus van zoogdieren kunnen induceren en, in sommige gevallen, hun daaropvolgende neurogenese-verbintenis kunnen veroorzaken 1,2,3,4,5. Dit blijft echter grotendeels onvoldoende voor behandelingen. Daarom is het vergroten van onze kennis van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan regeneratie noodzakelijk om moleculen te identificeren die in staat zijn om de eigenschappen van Müller-stamcellen efficiënt om te zetten in nieuwe cellulaire therapeutische strategieën.

Met dit doel voor ogen ontwikkelden we verschillende letselparadigma’s in Xenopus die retinale celdegeneratie veroorzaken. Hier presenteren we (1) een mechanisch netvliesletsel dat niet specifiek is voor het celtype, (2) een voorwaardelijk en omkeerbaar celablatiemodel met behulp van het NTR-MTZ-systeem dat zich richt op staafcellen, (3) een CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out , een model van retinitis pigmentosa dat progressieve staafceldegeneratie veroorzaakt, en (4) een CoCl2-geïnduceerd cytotoxisch model dat, afhankelijk van de dosis, zich specifiek op kegeltjes kan richten of kan leiden tot bredere degeneratie van retinale cellen. We belichten de bijzonderheden, voor- en nadelen van elk paradigma.

Protocol

Dierverzorging en dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen, onder de institutionele licentie A91272108. De onderzoeksprotocollen werden goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging CEEA #59 en kregen toestemming van de Direction Départementale de la Protection des Populations onder het referentienummer APAFIS #32589-2021072719047904 v4 en APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materiale…

Representative Results

Mechanisch netvliesletselRetinale secties van kikkervisjes die onderhevig zijn aan de mechanische verwonding beschreven in protocolsectie 1 tonen aan dat de retinale laesie alle lagen van het weefsel omvat, terwijl het beperkt blijft tot de punctieplaats (Figuur 2A,B). Voorwaardelijke staafcelablatie met behulp van het NTR-MTZ-systeemDe ogen van verdoofde Tg(rho:GFP-NTR) transgene kikkervisjes die…

Discussion

Voor- en nadelen van verschillende paradigma’s voor netvliesbeschadiging bij Xenopus-kikkervisjes

Mechanisch netvliesletsel
Verschillende chirurgische verwondingen van het neurale netvlies zijn ontwikkeld bij Xenopus-kikkervisjes. Het neurale netvlies kan ofwel volledig worden verwijderd15,16 of slechts gedeeltelijk worden weggesneden 16,17.<sup c…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies aan M.P. van de Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) en UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in samenwerking met ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Materials

1,2-Propanediol (propylène glycol) Sigma-Aldrich 398039
Absolute ethanol ≥99.8% VWR chemicals 20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) Cell signaling 9661S Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken) Aveslabs GFP-1020 Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5405 Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11005 Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit) Abcam Ab183951 Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11008 Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11012 Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5585 Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) Sigma-Aldrich MABN15 Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5407 Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) Promega G3250
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) Sigma-Aldrich B2883 Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5% VWR chemicals 20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.02382 Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) New England Biolabs M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 Warner Instruments (Harvard Apparatus) 30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) Sigma-Aldrich C8661 Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm VWR 631-1575
Dako REAL ab diluent  Agilent S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Electronic Rotary Microtome Thermo Scientific Microm HM 340E 
Eosin 1% aqueous RAL Diagnostics 312740
Fluorescein lysine dextran   Invitrogen Thermo Scientific D1822
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX 200
Gentamycin Euromedex EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory Diapath E0012 Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) RAL Diagnostics 320550
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
Human chorionic gonadotropin hormone MSD Animal Health Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) Sigma-Aldrich (SAFC) 1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich C7880 Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.05886
Metronidazole  Sigma-Aldrich (Supelco) M3761 Use at 10 mM
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) Sutter Instrument Co. Model P-97 Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent Millipore 345789
Mounting medium, Eukitt Chem-Lab CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade Epredia 3053835
Needle Agani 25 G x 5/8'' Terumo AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm Sefar 06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO Histolab 00403
Paraformaldehyde solution (32%) Electron Microscopy Sciences EM-15714-S Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Epredia 2219
Pestle VWR 431-0094
Petri Dish 100 mm Corning Gosselin SB93-101
Petri Dish 55 mm Corning Gosselin BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x Euromedex ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system Parker Instrumentation Products PicoSpritzer III
Pins  Fine Science Tools 26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) Sigma-Aldrich F4375 Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature sera 45475 (00720)
Scissors dissection Fine Science Tools 14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL Glass VS11171076FKA 
Slide warmer Kunz instruments HP-3
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) VWR chemicals 27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) VWR chemicals 28217-292
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL B-BRAUN 9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA) Integrated DNA Technologies 1072533
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator X-Cite  200DC
Xylene ≥98.5%  VWR chemicals 28975-325

Riferimenti

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Biologia dello sviluppo. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

Play Video

Citazione di questo articolo
Parain, K., Donval, A., Chesneau, A., Lun, J. X., Borday, C., Perron, M. Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (200), e65771, doi:10.3791/65771 (2023).

View Video