Summary
Ett protokoll presenteras för att utvärdera om små EV (sEV) isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden (modellering av en aspekt av havandeskapsförgiftning) stör blod-hjärnbarriären hos icke-dräktiga vuxna honmöss.
Abstract
Cerebrovaskulära komplikationer, inklusive hjärnödem och ischemisk och hemorragisk stroke, utgör den främsta orsaken till mödradödlighet i samband med havandeskapsförgiftning. De bakomliggande mekanismerna för dessa cerebrovaskulära komplikationer är fortfarande oklara. De är dock kopplade till placentadysfunktion och störningar i blod-hjärnbarriären (BBB). Sambandet mellan dessa två avlägsna organ håller dock fortfarande på att fastställas. Allt fler bevis tyder på att moderkakan frigör signalmolekyler, inklusive extracellulära vesiklar, i moderns cirkulation. Extracellulära vesiklar kategoriseras efter deras storlek, med små extracellulära vesiklar (sEV mindre än 200 nm i diameter) som kritiska signalpartiklar vid både fysiologiska och patologiska tillstånd. Vid havandeskapsförgiftning finns det ett ökat antal cirkulerande sEV i moderns cirkulation, vars signalfunktion inte är väl förstådd. Placenta sEV som frigörs vid havandeskapsförgiftning eller från moderkakor under normal graviditet som utsätts för hypoxi inducerar endoteldysfunktion i hjärnan och störning av BBB. I detta protokoll bedömer vi om sEV isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden (modellering av en aspekt av preeklampsi) stör BBB in vivo.
Introduction
Cirka 70 % av mödradödligheten på grund av havandeskapsförgiftning, ett hypertensivt graviditetssyndrom som kännetecknas av försämrade placenteringsprocesser, maternell systemisk endoteldysfunktion och, i allvarliga fall, multiorgansvikt 1,2, är förknippade med akuta cerebrovaskulära komplikationer 3,4. Den största delen av mödradödligheten inträffar i låg- och medelinkomstländer5. De bakomliggande mekanismerna är dock fortfarande oklara, trots den kliniska och epidemiologiska relevansen av cerebrovaskulära komplikationer i samband med havandeskapsförgiftning.
Å andra sidan är extracellulära vesiklar (EV) (diameter ~30-400 nm) viktiga mediatorer för intercellulär kommunikation mellan vävnader och organ, inklusive interaktion mellan moder och placenta6. Förutom proteiner och lipider på den yttre ytan bär EV last inuti (proteiner, RNA och lipider). EV kan kategoriseras i (1) exosomer (diameter ~50-150 nm, även kallade små EV (sEV)), (2) medelstora/stora EV och (3) apoptotiska kroppar, som skiljer sig åt i storlek, biogenes, innehåll och potentiell signalfunktion. Sammansättningen av EV bestäms av de celler som de kommer från och sjukdomstypen7. Syncytiotrofoblast-härledda EV uttrycker placenta alkaliskt fosfatas (PLAP)8,9, som detekterar placentae-härledda cirkulerande små EV (PDsEV) under graviditeten. PLAP hjälper också till att urskilja förändringar i PDsEVs last och deras effekter vid havandeskapsförgiftning kontra normotensiva graviditeter 10,11,12,13,14,15.
Moderkakan har erkänts som den nödvändiga komponenten i patofysiologin för preeklampsi16 eller cerebrala komplikationer i samband med denna sjukdom 17,18,19. Hur detta avlägsna organ kan inducera förändringar i hjärnans cirkulation är dock okänt. Eftersom sEV spelar en avgörande roll i cell-till-cell-kommunikation på grund av deras förmåga att överföra bioaktiva komponenter från donator- till mottagarceller 6,20,21, har ett växande antal studier associerat placenta-sEV med generering av moderns endoteldysfunktion 21,22,23,24, inklusive endotelceller i hjärnan 25,26hos kvinnor med havandeskapsförgiftning. Således kan komprometteringen av hjärnans endotelfunktion leda till störningar i blod-hjärnbarriären (BBB), en kritisk komponent i cerebrovaskulära komplikationer i samband med havandeskapsförgiftning 3,27.
Prekliniska fynd med cerebrala kärl hos råtta som exponerats för serum från kvinnor med preeklampsi28 eller endotelceller från human hjärna som exponerats för plasma från kvinnor med preeklampsi29 rapporterade dock att cirkulerande faktorer inducerar störning av BBB. Trots flera kandidater med potential att skada BBB som finns i moderns cirkulation under preeklampsi, såsom förhöjda nivåer av proinflammatoriska cytokiner (dvs. tumörnekrosfaktor)18,28 eller vaskulära regulatorer (dvs. vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF)))29,30,31, eller oxidativa molekyler såsom oxiderade lipoproteiner (oxo-LDL)32,33, bland annat34, ingen av dem visar att det finns ett direkt samband mellan moderkakan och BBB. Nyligen har sEV isolerat från hypoxiska moderkakor visat förmågan att störa BBB hos icke-dräktiga honmöss25. Eftersom sEV med moderkakan kan bära de flesta av de listade cirkulerande faktorerna med kapacitet att störa BBB, anses sEV vara lämpliga kandidater för att ansluta den skadade moderkakan, vara bärare av skadliga cirkulerande faktorer och störa BBB vid havandeskapsförgiftning.
Detta protokoll gör det möjligt för oss att undersöka om sEV isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden kan störa BBB hos icke-dräktiga honmöss som en proxy för att förstå patofysiologin för cerebrala komplikationer under preeklampsi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen har genomförts i enlighet med de principer som uttrycks i Helsingforsdeklarationen och med tillstånd av respektive etikprövningsnämnd. Alla mänskliga deltagare gav sitt informerade samtycke före provtagningen, som tidigare rapporterats25. Dessutom godkände bioetik- och biosäkerhetskommittén vid Bío-Bío-universitetet detta projekt (Fondecyt grant 1200250). Djurarbetet utfördes i enlighet med huvudprinciperna för de tre R:en vid användning av djur i försök35, och enligt rekommendationerna i riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur publicerade av US National Institute of Health. Djuren hölls i lämpliga miljöer vid Vivarium vid universitetet i Bío-Bío. Färska moderkakor (n = 4) erhölls inom 1 timme efter planerat kejsarsnitt från mödrar (i åldrarna 28-31 år) med normala graviditeter vid fullgången graviditet (38 till 41 veckors graviditet). Kejsarsnitt utfördes på Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, Chile, som tidigare rapporterats25. För att tillämpa in vivo-modellen användes 4-6 månader gamla icke-dräktiga honmöss (stam C57BLACK/6). De delades in i tre experimentella grupper: (1) kontroll (utan behandling), (2) behandlade med sEV från normoxia (sEVs-Nor) och (3) behandlade med sEV från hypoxiska odlade moderkakor (sEVs-Hyp), som användes för att utvärdera störningen av BBB in vivo25. Alla injicerade lösningar var sterila. Dessutom utfördes beredningen av elfordon under aseptiska förhållanden och under en biosäkerhetshuv av klass II för att undvika kontaminering.
1. Explantering av moderkakskultur
- För att extrahera explantat av moderkakor under normal graviditet, kontrollera metoden publicerad av Miller et al. 200536.
- Ta försiktigt bort propparna från den mänskliga moderkakans basala platta med steriliserad pincett. Extrahera små explantat för att erhålla en slutlig vävnadsextraktion på 10 g.
- Se till att placentaplantor avlägsnas från de fyra kvadranterna i modersdelen av moderkakan. Se till att devitaliserad vävnad och förkalkade områden utesluts.
- För att manipulera moderkaksvävnad, gör det på is, under sterila förhållanden och i ett biosäkerhetsskåp.
- Tvätta explantaten (minst tre gånger) med rikliga mängder (fem volymer av explantaten) kall (4 °C) fosfatbuffertlösning (PBS 1x, pH 7,4) för att avlägsna så mycket blod som möjligt. Centrifugera (252 x g i 10 min) i rumstemperatur mellan tvättarna.
- Omsuspendera 10 g tvättad explantat i 20 ml odlingsmedium kompletterat med 2 % fetalt bovint serum, 100 IE/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin (se materialförteckning).
- Lägg suspensionen i en 100 mm odlingsform. Låt explantorna stå i 2 timmar i en inkubator vid 37 °C med 21 % syre och 5 % CO2 .
- Tvätta sedan explantorna igen med 1x PBS vid 37 °C (tre gånger). Centrifugera (252 x g i 10 min) i rumstemperatur mellan tvättarna.
- Vidare, resuspendera vävnaden i 20 ml odlingsmedium som tidigare utarmats på nanopartiklar.
OBS: För utarmning av nanopartiklar, utför ultracentrifugering (120 000 x g i 18 timmar vid rumstemperatur) och mikrofiltrering (0.22 μm filter). - Dela upp den resuspenderade explanten i två kulturskålar (100 mm). Varje odlingsskål måste innehålla 10 ml resuspenderad explantat.
- Placera sedan en av skålarna som innehåller placentaexplantat under standardodlingsförhållanden (37 °C med 8 % syre och 5 % CO2), medan du placerar den andra i en hypoxisk kammare med 1 % O2 %.
ANMÄRKNING: (FRIVILLIGT) Analys av vävnadens viabilitet kan utföras med samma vävnadsextraktioner och 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidtest (MTT-test) som beskrivs på annan plats 37,38. Använd den totala proteinkoncentrationen uppmätt i explantationshomogenaten för att normalisera MTT-värdena. - Efter 18 timmar i odling, skörda det konditionerade mediet från explantorna i ett nytt 15 ml rör.
OBS: I detta steg kan konditionerade medier frysas (-80 °C) under en längre period (veckor).
2. Isolering av sEV från moderkakan
- Isolera sEV från det konditionerade mediet med hjälp av differentiell centrifugering och mikrofiltreringsprotokoll enligt tidigare publicerade rapporter 25,39.
- Utför sekventiell centrifugering för det skördade konditionerade mediet. Sekventiella centrifugeringssteg är (1) 300 x g i 10 minuter, (2) 2000 x g i 10 minuter, (3) 10 000 x g i 30 minuter och (4) 120 000 x g i 2 timmar. Utför centrifugeringarna rumstemperatur.
- I alla dessa centrifugeringar, med hjälp av en 20-100 μL pipett, samla försiktigt upp supernatanten och kassera pelleten.
- När det är klart, passera den senast uppsamlade supernatanten genom ett 0,22 μm filter (se Materialtabell). Utför därefter ytterligare en centrifugering vid 120 000 x g i 18 timmar vid rumstemperatur.
- Kassera därefter supernatanten medan du återsuspenderar pelleten (som innehåller placenta sEV) i 500 μL PBS (pH 7,4) och passerar igen genom ett 0,22 μm filter. Utför slutligen en sista centrifugering vid 120 000 x g i 3 timmar vid rumstemperatur.
- Återsuspendera sedan pelleten (som innehåller placenta sEV) i 500 μL PBS (pH 7,4, tidigare utarmad på sEV) och passera genom ett 0,22 μm filter.
- Märk proverna som lager av sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) eller sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
ANM.: Förbered 50-100 μL alikvoter av de isolerade sEV:erna för ytterligare experiment. Små elfordon kan förvaras vid -80 °C under en längre period (månader). - Karakterisera placenta-sEV efter storlek, antal och sEV-proteinmarkör, som rapporterats tidigare25. Den ideala genomsnittliga partikeldiametern för sEV är 50-150 nm.
OBS: karakterisering av sEVs inkluderar positiv detektion av CD63, Tsg101, Alix och HSP70 (dvs. för att karakterisera sEVs-populationen anrikad i exosomer). Använd också PLAP som en markör för placentaursprung25. - Mät den totala mängden protein i sEVs-lösningen med hjälp av BCA-proteinanalyskitet enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell).
OBS: Figur 1 visar en överview av placentaexplantkulturen och extracellulär vesikelisolering.
3. Injektion av möss
- Bedöva djuret i en anestesiinduktionskammare med 5 % isofluranfördelning (se materialförteckning). Kontrollera anestesinivån med ett nyp i tårna.
- Efter ~40 s, sätt musen i anestesisystemet med hjälp av en ansiktsmask och bibehåll en anestesinivå på 2 % isofluran.
- Placera sedan djuret på en värmeplattform (se materialtabell) vid en rumstemperatur på 28 °C. Håll ögonen smorda med konstgjorda tårar.
- Före injektion späds placenta-sEV (200 μg totalt protein) med fosfatbuffert (pH, 7,4) tills en slutlig volym på 70 μl uppnås.
- Desinficera injektionsområdet med 70 % etanol och bomullspinnar. Se till att använda en insulinspruta med en 30 G nål för att injicera sEVs-lösningen.
OBS: Sprutan kan placeras på värmeplattformen i 5 minuter för att få en fysiologisk temperatur. - Injicera sedan lösningen i den yttre halsvenen. Detta steg kräver särskild utbildning.
OBS: Proceduren måste utföras försiktigt, långsamt dra tillbaka nålen och försiktigt aspirera till tecken på blodreflux. - Efter injektionen, applicera lätt tryck på det injicerade området i ~15 s med en torr bomullspinne. Sätt sedan tillbaka djuren i sina respektive burar.
- Se till att utvärdera medvetande och beteende i 15 minuter. En indikator på medvetandeprestation är djurens återhämtning av total motorisk aktivitet.
OBS: Se till att hålla en varm temperatur i djurens burar.
4. Snabb murin koma och beteendeskala (RMCBS)
- Använd RMCBS för att utvärdera djurens neurologiska parametrar och välbefinnandeparametrar40.
OBS: RMCBS möjliggör en snabb utvärdering (~ 3 min) med minimal djurstress på grund av operatörsingripande. RMCBS har tio parametrar (varje poäng är 0-2). - Utvärdera musens välbefinnande med RMCBS-skalan vid 0 timmar (före injektion av sEV) och 3 timmar, 6 timmar, 12 timmar och 24 timmar efter injektion.
OBS: Utför analys av claudin-5 (6 timmar efter injektion av sEV) och Evans blå extravasering (24 timmar efter injektion av sEV) för att utvärdera störningen av BBB (figur 2).
5. Analys av Evans blå extravasering
- Efter injektion av sEV med moderkakan (24 timmar) bedövas mössen enligt beskrivningen i steg 3.1.
- Bered Evans blå lösning (2 %, utspädd i fosfatbuffertlösning, 1 x) (se materialförteckning).
- Använd retroorbital access25 och injicera Evans blå lösning med 2 ml/kg.
- Låt Evans blå lösning cirkulera i 20 minuter under underhåll av anestesi.
- Utför sedan intrakardiell perfusion enligt tidigare beskrivet protokoll41 med saltlösning (~3 ml, 0,9 %, vikt/volym) för att avlägsna Evans blå färgämne från cirkulationen. Det här steget är obligatoriskt.
OBS: För denna procedur, öka anestesin till 5 % och verifiera ett djupt anestesiplan (dvs. drastisk minskning av andningsfrekvensen). - Exponera hjärtat via medial torakotomi41 (Figur 3).
- Fixera sedan hela djuret med en intrakardiell infusion av paraformaldehydlösning (4 % i PBS, v/v).
OBS: Kontrollera svansens styvhet för att övervaka lämplig fixering. - Vidare, när fixeringen är klar, extrahera försiktigt hjärnan, väg den och fotografera den41. Ta bilder med hela hjärnan nära en linjal42.
- Placera sedan hjärnan i en hjärnmusskärare (se Materialförteckning).
- Dela upp hjärnan i nio sektioner, kran-kaudala, inklusive lillhjärnan (100 μm varje sektion).
- Efter dissektion, visualisera och ta bilder av hjärnskivorna i ett stereozoommikroskop (se Materialförteckning).
- Använd de tagna bilderna för att kvantifiera Evans blå extravasering med hjälp av programvaran ImageJ (se Materialförteckning).
OBS: För att analysera förekomsten av Evans blå färgämne, ställ in Evans blå värden med hjälp av en positiv kontroll av hjärnsektionen (från ett djurkontrolldjur injicerat med färgämne men utan intrakardiell perfusion). Evans blå värden som uppnås från positiv kontroll är i allmänhet mellan 75 och 110 i intensitetshistogrammet för den blå kanalen (figur 4). - Se till att hjärnbilder analyseras blint av respektive experimentgrupp för att undvika observatörsbias. Alternativt kvantifiera Evans blå extravasering genom hjärnhomogenisering följt av spektroskopi43.
OBS: I separata experiment, med hjälp av nyligen isolerade hjärnor från sEV-injicerade möss (6 timmar), analysera proteinnivåerna av claudin 5 (CLND-5) (se materialtabell), en kritisk tight junction som är involverad i tätheten hos BBB44 (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll utvärderar förmågan hos sEV som härrör från moderkakor odlade i hypoxi att störa BBB hos icke-dräktiga möss. Denna metod gör det möjligt att bättre förstå den potentiella kopplingen mellan moderkakan och hjärnan under normala och patologiska tillstånd. I synnerhet kan denna metod utgöra en proxy för att analysera placenta sEVs deltagande i uppkomsten av cerebrala komplikationer vid havandeskapsförgiftning.
Till skillnad från möss som injicerats med sEVs-Nor, visar möss som injicerats med sEVs-Hyp en progressiv minskning av den neurologiska poängen fram till 24 timmar (tabell 1), vilket tyder på sEVs-Hyp-förmågan att försämra hjärnans funktion.
Dessutom har hjärnor från möss i gruppen som injiceras med sEVs-Hyp högre färskvikt än de som isolerats från möss som injicerats med sEVs-Nor eller kontrollmöss (0,51 ± 0,008; 0,46 ± 0,008; 0,47 ± 0,01 g), vilket kan utgöra en grov indikator på hjärnödem45.
Kompatibelt med detta fynd gör detta protokoll det möjligt att identifiera Evans blå extravasering som en indikator på störning av BBB. I det avseendet har hjärnor från möss som injicerats med sEVs-Hyp högre Evans blå extravasering än hjärnor från sEVs-Nor-gruppen (Figur 5A).
Även om den underliggande mekanismen för störning av BBB inducerad av sEVs-Hyp inte analyserades med detta protokoll, indikerar resultaten också att sEVs-Hyp-injicerade möss visade minskade proteinmängder av CLND-5 i de områden där BBB var mest påverkad (dvs. bakre områden) (Figur 5B). Därför är det möjligt att sEVs-hyp försämrar uttrycket av funktionen hos detta kritiska endotelprotein.
Figur 1: Explantering av placenta och protokoll för isolering av extracellulära vesiklar. A) Normala explantkulturer med moderkaka. (B) Explantat är fördelat i två betingelser för biogenes av små extracellulära vesiklar (sEV) med placenta. Normoxia (sEVs-Nor, 8 % O2) eller hypoxi (sEVs-Hyp, 1 % O2) i 18 timmar. (C) Konditionerade medier skördas, filtreras och centrifugeras för att eliminera cellskräp. (D) EV isoleras genom ultracentrifugering. (E) sEV karakteriseras med hjälp av nanospårningsanalys och western blot. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: In vivo-utvärdering av protokoll för störningar i blod-hjärnbarriären. Icke-dräktiga C57BL6/J-möss, 4-6 månader gamla, används. (A) Via yttre halsvenen fick djuren sEV (200 μg totalt protein) isolerade från normoxiska (sEVs-Nor, 8 % O2) eller hypoxiska (sEVs-Hyp, 1 % O2) placentakulturer. RMCBS övervakas 0-24 timmar efter injektionen. (B) 6 timmar efter injektion av sEV extraheras hjärnorna och delas in i nio segment för proteinextraktion. Claudin 5 (CLDN5) analyseras i homogenat av dessa nio sektioner. (C) Evans blå extravaseringsanalys (24 timmar efter sEV-injektion) analyserades efter retroorbital punktionsinjektion i vart och ett av de nio segmenten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fotodokumentärer av Evans blå färgämne och intrakardiell perfusionsprotokoll. (A) Musen fick Evans blå genom retroorbital injektion. (Vänster) Djur före och (Höger) efter injektion (15 s) av Evans blå. (B) Thorakotomi för att utföra intrakardiell perfusion av fosfatbuffertlösning (1x PBS) och paraformaldehyd (4% PFA). Vänster kammare spetsas med nålspetsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av Evans blå extravasering efter injektion av sEVs. (A) Representativ bild av hela hjärnan som visar Evans blå extravasering. Den streckade linjen representerar nio sektioner som erhållits från hela hjärnan. (B) Hjärnan dissekeras med hjälp av en hjärnmusskärare. (C) Representativa bilder av hjärnskivor 24 timmar efter injektion av sEV. Kontroll (CTL), placenta vid normoxiska (sEVs-Nor) eller hypoxiska förhållanden (sEVs-Hyp). Skalstreck = 0,4 cm. (D) Digital kontur av hjärnsnitt med hjälp av ImageJ. (E) Histogram i den blå kanalen. Värden mellan 75-110 är associerade med Evans blå extravasering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Evans blå extravasering och claudin-5-nivåer hos möss som injicerats med sEV isolerade från placenta-explantat. (A) Procentuell andel av Evans blå (EB) extravasering med hänsyn till hela hjärnsektionerna. Kontroll (CTL, blå), placenta vid normoxiska (sEVs-Nor, röda) eller hypoxiska förhållanden (sEVs-Hyp, grön). (B) Relativa nivåer av claudin 5 (CLDN5) i de nio hjärnsektionerna erhölls från de tre experimentgrupperna. β-aktin används som lastningskontroll. Värdena är medelvärdet ± kvartilintervallet. Varje prick representerar ett enskilt försöksperson. *p < 0,05, **p < 0,005. p < 0,0001. p < 0,001; ANOVA-test följt av Bonferroni eftertest. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Tid (h) | Kontroll | sEVs-Normoxia | sEVs-Hypoxi | ANOVA |
| 0 | 18,75 ± 0,250 | 18,5 ± 0,288 | 18,75 ± 0,250 | Ns |
| 3 | 18,5 ± 0,866 | 17 ± 0,707 | 13.25 ± 1.750*α | 0.006 |
| 6 | 19,25 ± 0,750 | 17 ± 0,577 | 11.75 ± 1.250*α | 0.002 |
| 12 | 18,5 ± 0,645 | Kl. 16,75 ± 1,109 | 13 ± 0.816*α | 0.001 |
| 24 | 19,5 ± 0,288 | 17,75 ± 0,250 | 10.25 ± 0.853*α | <0.0001 |
| *p < 0,01 jämfört med kontroll. αp < 0,01 jämfört med sEVs-Normoxia | ||||
Tabell 1: Snabb muskoma och beteendeskala (RMCBS) efter 24 timmar efter injektion av sEV. Poängen uttrycks som medelvärdet ± SEM. Djurens poäng närmast 20 är standard, medan ju lägre poäng, desto högre dysfunktion i CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie avslöjar nya insikter om potentiella skador till följd av sEV isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden på störningen av gnagarblod-hjärnbarriären. Den patologiska mekanismen innebär en minskning av CLND-5 i den bakre hjärnregionen25.
Tidigare undersökningar har visat att plasma-sEV från individer med havandeskapsförgiftning inducerar endoteldysfunktion i olika organ med hjälp av in vitro-modeller 46,47. Denna undersökning granskade särskilt blod-hjärnbarriären och erbjöd ett nytt perspektiv på sEV isolerade från hypoxi-odlad moderkaka, vilket stör denna vitala barriär. Dessa upptäckter introducerar en ny forskningssfär där sEV kan fungera som en kommunikationskanal mellan moderkakan och hjärnan i både normala och patologiska scenarier, som havandeskapsförgiftning.
Det presenterade protokollet är enkelt, men flera kritiska steg förtjänar att nämnas. Detta protokoll kräver färska moderkakor inom 1 timme efter förlossningen. Vi avråder också från att förlänga odlingsperioden utöver 24 timmar för att förhindra vävnadsnedbrytning. Detta protokoll minskar potentiell kontaminering från sEV som produceras av moderkakor på möss. Digital analys av Evans blå extravasering är tidskrävande. Dessutom är Evans blåfärgning mindre iögonfallande efter hjärnsnitt. Därför rekommenderas en initial inställning för att identifiera det blå området med hjälp av en positiv kontroll. En negativ kontroll, till exempel en hjärna från en mus som inte utsätts för Evans blå injektion, kan också användas. Blind analys av experimentella grupper är absolut nödvändigt för att avvärja potentiell observatörsbias.
Flera utmaningar kan uppstå under detta protokoll. En betydande begränsning ligger i den biologiska variabiliteten som härrör från både mänskliga moderkakor och injicerade möss. För att säkerställa reproducerbarheten av Evans blå extravaseringsexperiment föreslås att sEV-doser isoleras från mänskliga moderkakor. Vi valde en dos på 200 μg totalt protein; Denna mängd kan dock fluktuera beroende på vesikelns renhet, effekten av jugular injektion, Evans administrering av blått, dess eliminering från cirkulationssystemet och, inte minst, den biologiska effekten av sEV med tanke på deras innehåll.
De cellulära mekanismerna genom vilka sEV från den mänskliga moderkakan kan störa blod-hjärnbarriären kräver ytterligare experiment. Icke desto mindre har denna metod relevans och antyder potentiell kommunikation mellan moderkakan och hjärnan, vilket motiverar ytterligare utforskning. Därför uppmuntras framtida undersökningar, med fokus på sEV och deras interaktioner med blod-hjärnbarriären, samt effekten av deras last på neuronala vävnader. Huruvida försämring av blod-hjärnbarriären leder till bestående konsekvenser för moderns hjärna motiverar ytterligare undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att redovisa.
Acknowledgments
Författarna vill tacka forskarna som tillhör GRIVAS Health för deras värdefulla bidrag. Även barnmorskor och klinisk personal från obstetrik och gynekologi tillhör Hospital de Chillan, Chile. Grundat av Fondecyt Regular 1200250.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
| Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
| Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
| BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
| Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
| D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
| Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
| Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
| Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
| Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
| Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
| Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
| PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
| Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
| ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
| Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
| Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
| Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
| Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
| Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |
References
- Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
- Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M.
- Hammer, E. S., Cipolla, M. J.
- Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
- Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
- Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
- Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
- Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
- Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
- Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
- Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5'-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
- Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
- Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000 (2019).
- Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
- Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia - A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
- Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
- Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670 (2014).
- Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
- Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
- Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
- Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M.
- Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
- Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
- Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
- Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
- Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
- Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier - a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
- Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451 (2022).
- Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
- Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
- Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
- Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , https://awionline.org/lab-animal-search/russell-w-m-s-burch-r-l-1959-principles-humane-experimental-technique-methuen-co (1959).
- Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
- Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2 (2015).
- Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22 (2006).
- Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124 (2010).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
- Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
- Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
- Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
- Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
- Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
- Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).
