Summary
Kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) multi-grid screening er ofte en kedelig proces, der kræver timevis af opmærksomhed. Denne protokol viser, hvordan du konfigurerer en standard Leginon kollektion og Smart Leginon Autoscreen for at automatisere denne proces. Denne protokol kan anvendes på de fleste kryoEM hullede foliegitre.
Abstract
Fremskridt inden for kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) teknikker i løbet af det sidste årti har gjort det muligt for strukturelle biologer rutinemæssigt at løse makromolekylære proteinkomplekser til næsten atomopløsning. Den generelle arbejdsgang for hele cryoEM-pipelinen involverer iterering mellem prøveforberedelse, forberedelse af kryoEM-gitter og prøve-/gitterscreening, før der går videre til dataindsamling i høj opløsning. Gentagelse mellem prøve- / gitterforberedelse og screening er typisk en stor flaskehals for forskere, da hvert iterativt eksperiment skal optimere for prøvekoncentration, bufferbetingelser, gittermateriale, gitterhulstørrelse, istykkelse og proteinpartikeladfærd i isen, blandt andre variabler. Når disse variabler er tilfredsstillende bestemt, varierer gitre, der er udarbejdet under identiske betingelser, desuden meget med hensyn til, om de er klar til dataindsamling, så yderligere screeningssessioner, inden der vælges optimale net til dataindsamling i høj opløsning, anbefales. Denne prøve- / gitterforberedelses- og screeningsproces bruger ofte flere dusin gitre og dage med operatørtid ved mikroskopet. Desuden er screeningsprocessen begrænset til operatør / mikroskoptilgængelighed og mikroskoptilgængelighed. Her demonstrerer vi, hvordan du bruger Leginon og Smart Leginon Autoscreen til at automatisere størstedelen af cryoEM grid screening. Autoscreen kombinerer maskinlæring, computervisionsalgoritmer og mikroskophåndteringsalgoritmer for at fjerne behovet for konstant manuel operatørinput. Autoskærm kan autonomt indlæse og billedgitre med billedbehandling i flere skalaer ved hjælp af et automatiseret prøveudvekslingskassettesystem, hvilket resulterer i uovervåget gitterscreening for en hel kassette. Som følge heraf kan operatørtiden til screening af 12 gitre reduceres til ~10 min med Autoscreen sammenlignet med ~6 timer ved hjælp af tidligere metoder, som hæmmes af deres manglende evne til at tage højde for høj variabilitet mellem gitre. Denne protokol introducerer først grundlæggende Leginon opsætning og funktionalitet, derefter demonstrerer Autoscreen-funktionalitet trin for trin fra oprettelsen af en skabelonsession til slutningen af en 12-grid automatiseret screeningssession.
Introduction
Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi (cryoEM) muliggør bestemmelse af næsten atomopløsningsstruktur af rensede makromolekylære komplekser. Et enkelt partikelkryoEM-eksperiment kræver kun et eller to velvalgte gitre udvalgt fra et meget større sæt gitre med varierende prøve- og gitterforhold. Mikroskopscreening for at undersøge disse net indebærer billeddannelse af hvert gitter ved flere forstørrelser for at bestemme, hvilket gitter der opfylder de fleste nøglekrav til dataindsamling med høj opløsning, herunder istykkelse, tilstrækkelige områder til fuld dataindsamling, proteinrenhed, proteinkoncentration, proteinstabilitet og minimale foretrukne orienteringsproblemer1. Optimering til disse nøglekrav involverer ofte feedback mellem screening ved mikroskopet og præparationsbetingelser såsom proteinproduktion, buffervalg, potentielle vaskemidler og gittertype 2,3,4 (figur 1). Konventionel gitterscreening udføres manuelt eller semi-manuelt med software som Leginon5, SerialEM6 og EPU7. Konventionel screening kræver, at mikroskopoperatøren bruger timer ved mikroskopet for at screene flere net, hvilket skaber en betydelig flaskehals i arbejdsgangen med enkelt partikler med høj opløsning ved at optage operatøren med roteoperationer snarere end prøve / gitteroptimering.
Tidligere er Smart Leginon Autoscreen og den underliggende maskinlæringssoftware, Ptolemæus, blevet introduceret, og deres underliggende metoder og algoritmer er sammen med eksempler beskrevet 8,9. Flere andre softwarepakker er enten i stand til eller arbejder hen imod fuldautomatisk multi-grid screening10, herunder SmartScope11, Smart EPU12 og CryoRL13,14. For at løse screeningsflaskehalsen giver Smart Leginon brugeren mulighed for først at oprette screeningsparametre i en skabelonmikroskopsession og derefter bruge skabelonsessionens parametre som en skabelon til at screene den fulde kassette af gitre i mikroskopets autoloader. Alt manuelt arbejde under kassettescreeningen elimineres, hvilket gør det muligt for optimeringsfeedbacksløjfen at fortsætte betydeligt mere effektivt.
I denne protokol er den fulde Smart Leginon Autoscreen-arbejdsgang beskrevet, så læseren kan udføre fuldautomatisk multi-grid cryoEM-screening uafhængigt. For dem, der er nye til Leginon, beskriver det første afsnit i protokollen konventionel Leginon brug. Denne viden er sammensat af flere års erfaring på tværs af flere autoloadermikroskoper, som derefter bygges videre på i den efterfølgende Smart Leginon sektion af protokollen. Yderligere vejledningsvideoer kan findes på https://memc.nysbc.org.
Protocol
For at følge denne protokol, der er afbildet i figur 2, skal Leginon 3.6+ installeres på mikroskopcomputeren og på en ekstra Linux-arbejdsstation, og Ptolemæus skal installeres på Linux-arbejdsstationen. Denne protokol er udviklet over flere år ved hjælp af Thermo Fisher Scientific (TFS) Glacios og Krios mikroskoper. Denne protokol forudsætter, at læseren allerede har konfigureret Leginon, Appion15, den tilhørende database, mikroskopkalibreringer, udført direkte justeringer på mikroskopet og har oprettet to Leginon Applications: En til standard enkelt partikelsamling og en til enkelt partikelsamling med Ptolemæus. Oplysninger om opsætning af Leginon findes her: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual. Oplysninger om opsætning af Ptolemæus inden for Leginon er tilgængelige her: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening. Download Leginon fra http://leginon.org og Ptolemæus fra https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy. Leginon er licenseret under Apache-licensen, version 2.0, og Ptolemæus er licenseret under CC BY-NC 4.0.
1. Brug af Leginon
- Start Leginon
- På mikroskopets Windows-computer skal du lukke alle Leginon-klienter og derefter åbne den igen. I Linux-arbejdsstationen skal du åbne et terminalvindue og skrive start-leginon.py eller systemets passende alias til start af Leginon.
- I det nye Leginon Setup-vindue skal du vælge Opret en ny session og klikke på Næste.
- Vælg projektet på rullelisten, og klik på Næste.
- Lad navnet være, som det er, vælg den korrekte holder til mikroskopopsætningen, og klik på Næste.
- For beskrivelsen skal du indtaste relevante oplysninger såsom mikroskopnavn, gitter-/prøvebeskrivelse og eksperimentbeskrivelse og derefter klikke på Næste.
- For billedmappen skal du sørge for, at det korrekte filsystem er valgt, og at den fulde sti er egnet til at gemme billeder, og derefter klikke på Næste.
- Under Opret forbindelse til klienter skal du klikke på Rediger. I rullemenuen skal du vælge alle de computere, der skal tilsluttes, klikke på knappen + for hver og derefter klikke på OK og Næste.
- Indtast den korrekte C2-blændestørrelse, og klik på Næste. Denne værdi findes på fanen Apertures i TFS TUI-softwaren.
- Leginon grænseflade
- Vælg Program på værktøjslinjen, og klik på Kør.
- Vælg det korrekte program i rullemenuen (klik om nødvendigt på Vis alle ). Indstil hoved til Leginon computer og omfang og kamera til den respektive computer, og klik derefter på Kør. Venstre side af Lemininon-hovedvinduet udfyldes med noder.
BEMÆRK: Det venstre panel viser alle Leginon noder. De grønne kameraikonnoder er de billeder, der gemmes: Gitter, Firkant, Hul og Eksponering. Noder med måltegnet er billeder med lavere forstørrelse til målretning mod billeder med højere forstørrelse. De lilla kameranoder er de noder, der er programmeret til at finde eucentrisk z-højde og eucentrisk fokus. Derudover er der noder til at justere nultabstoppet, overvåge buffercyklus, overvåge flydende nitrogenfyldning, indsamle forstærkningskorrektionsbilleder, beregne istykkelse (IceT) og navigere i gitteret gennem forskellige forstørrelser ved hjælp af fase- og billedskift. - Styring af forudindstillinger
- Klik på Presets_Manager node. I den knude skal du klikke på det nederste ikon for import af forudindstillinger eller ikonet over den for at oprette en ny forudindstilling fra mikroskopets aktuelle tilstand.
- Hvis der klikkes på det nederste ikon, åbnes et vindue med importforudindstillinger . Vælg det korrekte TEM og digitale kamera, klik derefter på Søg , og vælg den seneste session med de ønskede forudindstillinger. Fremhæv alle ønskede forudindstillinger, klik på Importer, og klik derefter på OK.
BEMÆRK: Noden Presets Manager skal nu vise alle importerede og oprettede forudindstillinger. Det anbefales at have forudindstillinger til flere forstørrelser og fokusering, herunder gr: Gitterforstørrelse, sq: Firkantet forstørrelse, hln: Hulforstørrelse, ventilator: Autofokus, fcn: Central fokus, enn: Eksponeringsforstørrelse (efterfølgende 'n' henviser til nanosonde). Typiske forudindstillede parametre for hver forstørrelse er vist i tabel 1, tabel 2 og tabel 3. Bemærk, at denne protokol bruger en C2-blændestørrelse på 70 μm til Glacios, 50 μm til Krios med en Selectris X og Falcon 4i og 100 μm til Krios med et BioQuantum med en K3.
- Navigation og eucentrisk højde
- For at blive fortrolig med at styre mikroskopet gennem Leginon og indstille gitterets z-højde skal du gå til navigationsnoden, vælge gr-forudindstillingen øverst og klikke på den røde pil til højre for at sende de forudindstillede indstillinger til mikroskopet. Mikroskopet skal opdateres efter 1-2 s. Når den er opdateret, skal du klikke på kameraknappen til højre for at hente et billede.
- Brug markørværktøjet til at vælge en gitterfirkant for, hvor scenen skal flyttes. Klik på sq-forstørrelsen og derefter den røde pil , der skal sendes til mikroskopet, og klik på kameraknappen for at få et billede.
- Gå til Z_Focus node , og klik på knappen Simuler mål øverst nær midten af knapperne. Mens billeder indsamles til fokusering af scenehældning, skal du skifte til korrelationsvisning og se toppen for at sikre, at den er i hjørnet af korrelationsbilledet. Når fokuseringen er færdig, skal du sikre dig, at scenen er indstillet til gitterets z-højde.
- Koma korrektion
BEMÆRK: Dette underafsnit forudsætter, at der allerede er udført direkte justeringer, og at komakorrektioner ikke er udført.- Naviger til et område af gitteret, der producerer klare Thon-ringe, såsom kulstofsubstrat.
BEMÆRK: En krydsrist kan bruges, hvis indsamling skal ske på et guldgitter. - I indstillingerne for Beam_Tilt_Image skal du sikre dig, at rækkefølgen af forudindstillinger kun omfatter fcn med fire hældningsretninger i en vinkel på 0,005 radianer.
- Klik på Simuler mål for at oprette et Zemlin tableau. Klik på Tableau i venstre side af hovedvinduet for at se tableauet.
- Korrekt for koma ved at sammenligne venstre og højre Fourier-transformationer med hinanden, og den øverste og nederste Fourier-transformation med hinanden. Hvis billedparrene ikke er identiske, skal du først klikke på markørikonet til højre for billedjusteringerne, derefter klikke lidt væk fra midten i Tableau-billedet i retning af forskellen og vente på, at et nyt sæt Fourier-transformationer indsamles. Gentag, indtil Fourier-transformationerne er identiske.
BEMÆRK: Hvert Tableau-klik tager flere sekunder at fuldføre, og der skal ikke foretages yderligere klik i løbet af denne tid.
- Naviger til et område af gitteret, der producerer klare Thon-ringe, såsom kulstofsubstrat.
- Få referencer
BEMÆRK: Spring dette afsnit over, hvis kameraet har automatiske hardwarereferencer.- I navigationsnoden skal du sende en forudindstilling med lav forstørrelse, f.eks. gr, og navigere til et område, hvor der ikke er nogen hindring for strålebanen.
- Bekræft, at scenepositionen er på et sted, der ikke er blokeret af strålebanen, ved at tage et medium forstørrelsesbillede ved hjælp af forudindstillingen sq eller hln .
- Send den forudindstillede forudindstilling med høj forstørrelse til mikroskopet.
- I indstillingerne for korrektionsnoden skal du vælge de korrekte instrumentoplysninger og konfigurere kamerakonfigurationen , så den passer til samlingsindstillingerne.
- Indsaml et mørkt referencebillede ved at lukke søjleventilerne på mikroskopet, vælg derefter Mørk og Begge kanaler i rullemenuen øverst i korrektionsnoden og klik på knappen Hent kamera til højre.
- Når du er færdig, skal du vælge Bright i rullemenuen og klikke på Erhverv. Leginon åbner søjleventilerne automatisk.
- Kontroller, at gevinsten blev indsamlet korrekt ved at vælge Korrigeret i rullemenuen, klikke på Hent og observere det resulterende billede.
- Referencebillede af istykkelse
- Hvis mikroskopet har et energifilter, skal du i indstillingerne for IceT-noden markere Indsaml istykkelsesbillede, indtaste 395 for den gennemsnitlige frie sti og udfylde resten af værdierne for opsætningen.
- Hvis mikroskopet ikke har et energifilter, skal du sende enn-forudindstillingen til mikroskopet i navigationsnoden og klikke på Erhverv. Notér middelpixelværdien i venstre side. I indstillingerne for IceT-noden skal du markere Beregn istykkelse fra begrænset spredning af blændeåbning, indtaste 1055 for ALS-koefficienten og den målte gennemsnitlige pixelværdi.
BEMÆRK: Værdierne 395 og 1055 blev bestemt for henholdsvis TFS Krios og Glacios, som beskrevet tidligere16, og skal muligvis kalibreres igen til forskellige mikroskopkonfigurationer.
- Kalibrering af billeddosis
- I Preset_Manager skal du vælge forudindstillingen enn og klikke på kameraknappen (Hent dosisbillede for den valgte forudindstilling). Kontroller den målte dosis i bunden. Hvis den er tæt på den forventede værdi (typisk mellem 30 og 70), skal du klikke på JA.
- Forudindstillede justeringer
- I Preset_Manager skal du kontrollere alle forudindstillingerne for høj forstørrelse (enn, fcn og blæser) for at sikre, at billedskiftet og stråleforskydningen er 0, 0.
- På mikroskopcomputeren skal du navigere til et kulstofområde.
- På Leginon computeren i navigationsnoden skal du hente et billede med gr forudindstillingen.
- Find et objekt af interesse, og gå til det sted ved hjælp af markørværktøjet.
- Få et billede med hln-forudindstillingen , og flyt en unik del af objektet af interesse til midten ved hjælp af markørværktøjet.
- Få et billede med enn-forudindstillingen , og flyt det til den samme unikke del af objektet af interesse ved hjælp af markørværktøjet.
- Vælg billedskift i rullemenuen, og hent et billede med hln-forudindstillingen. Flyt til den samme unikke del af objektet af interesse med markørværktøjet.
- Vælg hln-forudindstillingen i Presets_Manager, klik påknappen s ettings, og importer billedskiftet fra Navigation ved at klikke på den venstre grønne pil ved siden af billedforskydningsværdierne.
- Gentag trin 2.9.7 og 2.9.8 for forudindstillingerne sq og gr .
- Gitteratlas
- På mikroskopcomputeren skal du lukke søjleventiler og trække objektivblænden tilbage . Gå til Grid_Targeting-noden. I indstillinger skal du ændre gitterets etiket. Vælg den ønskede radius af atlaset (den maksimale radius er 0,0009 m). Klik på OK. Klik derefter på knappen Beregn atlasberegner øverst, og klik på den grønne Play-knap ('Indsend mål').
- I den Square_Targeting knude indsamles gitterbillederne og sys sammen for at danne et atlas. Zoom ind og ud ved hjælp af rullemenuen , og juster kontrast og lysstyrke. Brug rullepanelerne til at bevæge dig gennem gitteret.
- Når atlasset er indsamlet, skal du indsætte objektivblænden, hvis det ønskes.
- Hvis mikroskopet har et energifilter, skal du vælge et referencemål i midten af en brudt firkant, trykke på knappen Afspil og fortsætte med ZLP-justering i følgende underafsnit. Ellers skal du springe ZLP-justeringstrinnet over.
- ZLP-justering
- I indstillingerne for Align_ZLP noder skal du vælge stage position for at flytte referencemålet og vælge forudindstillet manager som flyttefirma. Fravælg bypass conditioner, og tryk derefter på OK.
BEMÆRK: ZLP-justering skal nu konfigureres, så mikroskopet periodisk bevæger sig til referencemålet og udfører kameraets ZLP-justeringsrutine. ZLP-justeringstider på 30 min og 60 min er typisk sikre for henholdsvis Gatan BioQuantum og TFS Selectris X energifiltre. Disse værdier varierer afhængigt af energifilterforholdene, herunder ensartet fugtighed, ensartet temperatur, elektromagnetisk feltisolering og vibrationsisolering.
- I indstillingerne for Align_ZLP noder skal du vælge stage position for at flytte referencemålet og vælge forudindstillet manager som flyttefirma. Fravælg bypass conditioner, og tryk derefter på OK.
- Opsætning af målretning efter hulskabelon
- Vælg flere anskaffelsesmål i noden Square_Targeting, og tryk derefter på Afspil.
- I indstillingerne for Hole_Targeting node skal du sørge for, at Tillad brugerbekræftelse af valgte mål og Sæt mål i kø er markeret. Tjek også Spring automatisk hulfinder over for nu. Klik på Anvend og derefter på OK.
- I hovedvinduet skal du bruge Ctrl-Shift-højreklik for at fjerne alle mål. Vælg anskaffelsesmarkøren , og placer målene. Vælg fokusmarkøren, og placer et fokusmål mellem anskaffelsesmålene . Klik på Afspil.
- For det næste Hole_Targeting billede skal du fjerne markeringen i Spring automatisk hulfinder over i indstillinger og derefter klikke på Anvend og OK. Fjern de automatiske mål med Ctrl-Shift-højreklik.
- Vælg linealværktøjet, og mål diameteren på tværs af et hul. I skabelonindstillinger skal du ændre den endelige skabelondiameter til den målte huldiameter. Du må ikke ændre diameteren på den oprindelige skabelon. Klik på Test. Hvis lyse toppe ikke er i midten af hvert hul, skal du øge den endelige skabelondiameter. Når du er færdig, skal du klikke på OK.
- I tærskelindstillingerne skal du vælge en værdi for A , der segmenterer hullerne individuelt, når der klikkes på Test . Klik på OK , når du er tilfreds.
- I Blobs-indstillingerne skal du indtaste værdierne og klikke på Test. Værdien Maks. blobs er 1, så der vises kun én blob. Klik på OK.
- I gitterindstillinger skal du bruge linealværktøjet til at måle afstanden mellem to huller (center til center). Indtast værdien i Afstand, og klik på Test. Den ene klat bliver til et gitterpunkt. Klik på OK.
- Gå til anskaffelsesindstillinger, og optimer anskaffelsesmålene ved hjælp af istykkelsestærskler og knappen Test målretning. Få oplysninger om istykkelse ved at holde markøren over gitterpunkterne.
- Hvis anskaffelsesmålene ikke er tilfredsstillende, kan du bruge linealværktøjet til at måle afstanden og vinklen fra gitterpunktet til den ønskede placering for et anskaffelsesmål. Slet de tidligere anskaffelsesmålskabelonpunkter . Klik på Auto Fill, sæt 4 for antallet af mål, og skift radius og vinkel til de målte værdier. Klik på OK. Markér Anvend istykkelsestærskel på skabelonindviklede anskaffelsesmål.
- Når du er tilfreds med gitterpunkterne og istykkelsestærsklerne, skal du klikke på knappen Indsend mål .
- Gentag et af ovenstående trin efter behov for hver firkant, der blev markeret. Indsend hele køen med knappen Send mål i kø, når alle de firkantede mål er indsendt.
- Leginon vil begynde at fokusere og billeddanne hvert sæt mål. I den Z_Focus knude skal du sørge for, at den eucentriske højde findes korrekt.
- Opsætning af målretning efter eksponeringsskabelon
- I noden Målretning mod eksponering vises billeder af hulforstørrelse. Brug Ctrl-Shift-højreklik for at fjerne de automatiske mål.
- Mål diameteren på et hul med linealværktøjet. I skabelonindstillingerne skal du indtaste diameteren i Endelig skabelondiameter og klikke på Test. En top skal nu være i midten af hvert hul. Juster diameterværdierne , hvis det er nødvendigt.
- I tærskelindstillingerne skal du justere A-værdien , indtil det binariserede testbillede kun viser hvide områder, hvor hullerne er placeret.
- I indstillingerne for Blobs skal du klikke på Test. En klat pr. Segmenteret hul skal vises. Forøg kanten for at fjerne blobs fra billedets kanter, hvis det ønskes.
- I gitterindstillingerne skal du klikke på Test. Juster parametre, indtil alle blobs er blevet til gitterpunkter. Klik på OK.
- Klik på linealværktøjet og mål afstanden mellem to gitterpunkter. I gitterindstillingerne skal du ændre afstanden til den afstand.
- Hold markøren over hvert gitterpunkt for at se middelintensiteten, middeltykkelsen, standardafvigelsesintensiteten og standardafvigelsestykkelsen. Notér intensiteterne for hvert gitterpunkt, og brug dem til at indstille de ønskede istykkelsesparametre i anskaffelsesindstillingerne.
- Mål afstanden og vinklen fra et gitterpunkt til midten af 4 huller med linealværktøjet. I anskaffelsesindstillingerne skal du slette de aktuelle fokusmål. Klik på Autofyld, og skift radius og vinkel til de målte værdier. Klik på Test målretning, klik på OK, og klik på Send mål.
BEMÆRK: Leginon finder eucentrisk fokus (fokusknude) og indsamler eksponeringer, som vises i eksponeringsnoden. - Når alle mål er afbildet, skal du gå til den Exposure_Targeting node for at se det næste hulbillede. I indstillingerne skal du fjerne markeringen i Tillad brugerbekræftelse af valgte mål. Fjern også markeringen i kø op mål og Spring automatisk hulfinder over. Klik på OK , og klik på Send mål.
BEMÆRK: Leginon indsamler automatisk billeder baseret på ovenstående indstillinger. Se billederne og metadataene i Appion.
- Ændringer kan foretages under automatisk indsamling. Du kan f.eks. når som helst ændre samlingens defokuseringsområde ved at redigere enn-forudindstillingen i Preset_Manager.
- Hvis indsamlingen skal stoppes, skal du afslutte køen ved at klikke på knapperne Afbryd og Afbryd kø i noderne Hul og Eksponering.
- Når samlingen er færdig, skal du gå til Program og klikke på Dræb, derefter gå til Filer og klikke på Afslut.
2. Smart Leginon Autoscreen brug
- Opret en Smart Leginon skabelonsession
- Følg vejledningen i afsnit 1 for at starte Leginon.
- Gå til Program , og klik på Kør. I vinduet Kør program skal du vælge Ptolemæus-applikationen (vælg Vis alle , hvis det er nødvendigt). Indstil hoved til Leginon computer og omfang og kamera til den respektive computer.
- I Preset_Manager skal du importere forudindstillinger som beskrevet i trin 1.2.3.
- Konfigurer nodeindstillinger.
- I indstillingerne for Square_Targeting noder skal du sørge for, at Sortér mål efter korteste sti og Aktivér automatisk målretning er markeret (supplerende figur 1A).
- I indstillingerne for firkantet node skal du sørge for, at Vent på, at noden behandler billedet er markeret. Tilføj Square forudindstillet til listen til højre fra rullemenuen, hvis den ikke allerede er der. I Avancerede indstillinger skal du markere Indstil disse blænder under billeddannelse, og sørg for, at værdierne for de to blænder er korrekte (supplerende figur 1B).
- I indstillingerne for Hole_Targeting node skal du markere Tillad brugerbekræftelse af valgte mål. Fjern markeringen af Sæt mål i kø og Spring automatisk hulfinder over (supplerende figur 2A).
- I indstillingen Hulnode skal du markere Vent på, at en node behandler billedet, og forudindstillingen Hul er på listen til højre. I Avancerede indstillinger skal du markere indstil disse blænder under billeddannelse og sikre, at værdierne for de to blænder er korrekte (supplerende figur 2B).
- I indstillingerne for Exposure_Targeting noder skal du markere Tillad brugerbekræftelse af valgte mål. Fjern markeringen af Sæt mål i kø og Spring automatisk hulfinder over (supplerende figur 3A).
- I indstillingerne for eksponeringsnode skal du sørge for, at Vent på, at en node behandler billedet ikke er markeret, at forudindstillingen Eksponering er angivet til højre, og i Forhåndsindstillinger skal du markere indstil disse blænder under billeddannelse og sikre, at værdierne for de to blændeåbninger er korrekte (supplerende figur 3B).
- I indstillingerne for fokusnoden skal du sørge for, at Vent på, at en node behandler billedet ikke er markeret, at forudindstillingen Autofokus vises til højre, og at den ønskede autofokusnøjagtighed er indstillet til 4 x 10-6 m (supplerende figur 4A).
- I fokusnodefokussekvensen (ved siden af indstillingsknappen) skal du kun aktivere to trin med automatisk fokus på strålehældning (supplerende figur 4B,C).
- I indstillingerne for Z_Focus node skal du sørge for, at Vent på, at en node behandler billedet ikke er markeret, at forudindstillingen Hul er angivet til højre, og at den ønskede autofokusnøjagtighed er 5 x 10-5 m (supplerende figur 5A).
- I fokussekvensen med Z_Focus noder skal du kun aktivere to hældningstrin med lav forstørrelse (supplerende figur 5B,C).
- Gitterets z-højde bestemmes som beskrevet i trin 1.2.4.
- Indsaml et atlas som beskrevet i trin 1.2.10.
- Indstil kvadratiske finderparametre.
- Når atlaset er indsamlet, vil Ptolemæus finde firkanter i den Square_Targeting knude. Hver firkant viser en blå cirkel, kaldet en blob. Når du holder markøren over hver blob, rapporterer Leginon deres størrelse som beregnet af Ptolemæus. Bemærk de største og mindste klatter.
- I indstillingerne Tærskelværdi skal du ændre minimum- og maksimumfilterområdet for at medtage ønskelige firkanter og udelukke uønskede firkanter.
- Klik på knappen Find firkanter i den øverste værktøjslinje. Juster filterområdet , indtil Find firkanter målretter godt.
- I anskaffelsesindstillingerne skal du vælge værdier for det maksimale antal mål og antallet af målgrupper, der skal prøves. Disse parametre definerer, hvor mange kvadrater og grupper af kvadrater der målrettes.
- Når du er tilfreds med parametrene, skal du klikke på knappen Afspil . Et eksempel på atlas efter opsætning er vist i supplerende figur 6.
- Konfigurer hulfinderparametre.
- I Hole_Targeting-noden skal du bruge linealværktøjet til at måle diameteren på et hul.
- I skabelonindstillingerne skal du indtaste diameteren i Endelig skabelondiameter og klikke på Test. Juster diameteren, indtil alle huller har lyse hvide toppe i midten.
- I tærskelindstillingerne skal du klikke på Test. Juster A-værdien , indtil det binariserede billede kun viser hvide områder, hvor hullerne er placeret.
- I indstillingerne for Blobs skal du vælge at udelade kantmål ved at bruge linealen til at bestemme en minimumafstand fra kanten og indtaste denne værdi. Blobs kan filtreres efter deres størrelse, rundhed og ønskede antal. Hold markøren over klatter for at vise deres værdier. Klik på Test for at undersøge aktuelle værdier.
- I gitterindstillingerne skal du indtaste hullernes radius og afstanden mellem hullerne (brug måleværktøjet) og derefter klikke på knappen 42 for at måle referenceintensitetsværdien for et vakuumområde (tomt hul eller ødelagt støttefilm).
- I anskaffelsesindstillingerne skal du markere Brug undersæt af anskaffelsesmålene og angive værdien Maksimalt eksempel til et lille tal, f.eks. 2. Indstil en bred vifte af istykkelsesmidler og standardafvigelser (mål disse værdier ved at svæve over mål). Klik på Test målretning for at randomisere målretningen ud fra ovenstående værdier.
- Klik på knappen Afspil , når du er tilfreds med alle indstillinger. Leginon vil udføre fase Z_Focus og indsamle det første mål. Et eksempel på et billede efter opsætning er vist i supplerende figur 7.
- Konfigurer parametre for målretning mod eksponering.
- I Hole-indstillingerne skal du indstille Shell-scriptet til den hl_finding.sh scriptsti i Ptolemæus-installationen. Indstil minimumsscoren til at acceptere til at være ≤0. Indtast hullernes radius (brug måleværktøjet), og klik derefter på knappen 42 for at måle referenceintensitetsværdien for et vakuumområde (tomt hul eller ødelagt støttefilm). Klik på Test for at finde gitteret af huller.
- I anskaffelsesindstillinger skal du markere Brug delmængde af anskaffelsesmålene og angive værdien Maksimal prøve til et lille tal, f.eks. 4, for at indsamle på et undersæt af huller til screening. Indstil en bred vifte af istykkelsesmidler og standardafvigelser (mål disse værdier ved at svæve over mål).
- Klik på knappen Afspil , når du er tilfreds med alle indstillinger. Leginon vil udføre eucentrisk fokus og indsamle billeder med høj forstørrelse, som kan ses i eksponeringsnoden . Et eksempel på et billede efter opsætning er vist i supplerende figur 8.
- Tjek det næste Exposure_Targeting billede for at se, om indstillingerne ovenfor stadig er tilstrækkelige. Når du er tilfreds, skal du fjerne markeringen af Tillad brugerbekræftelse af valgte mål i indstillingerne for eksponeringsmålretning og hulmålretning.
BEMÆRK: Screening skal nu køre uden opsyn for det aktuelle net. Denne session vil blive brugt som skabelonsession for alle gitre.
- Når gitteret er færdigt med screeningen, skal du klikke på Filer > Afslut for at lukke Leginon.
- Opsætning af Smart Leginon Autoscreen
- I et terminalvindue skal du udføre Smart Leginons autoscreen.py.
- Vælg gui, indtast en kommasepareret liste over gitterpladser, der skal screenes, input fuld til arbejdsgangen, indtast skabelonsessionsnavnet for at basere nye sessioner på (dette kan findes i Appion imageviewer), og indtast skabelonsessionens z-højdeværdi (supplerende figur 9).
- En gui åbnes, så man kan indtaste sessionsnavnet for hvert gitter og vælge deres respektive projektforeninger (supplerende figur 10).
BEMÆRK: Smart Leginon Autoscreen bruger nu skabelonsessionsindstillingerne til automatisk at screene hvert gitter og skifte mellem gitre uden opsyn. - Følg med under indsamlingen i Leginon, Appel og mikroskopcomputeren, eller lad mikroskopet være helt uden opsyn.
BEMÆRK: Når alle gitre er screenet, lukker Smart Leginon søjleventilerne på mikroskopet.
Representative Results
I henhold til protokollen kan cryoEM-screeningssessioner køres automatisk og med succes for størstedelen (80%-90%) af hullede gitre og forhold. Flere eksempler og eksperimenter er blevet præsenteret tidligere 8,9 for at demonstrere de forventede resultater af vellykkede Smart Leginon Autoscreen-sessioner. En vellykket Autoscreen-session begynder med ~10 minutters opsætning og resulterer normalt i en fuld kassette med 12 gitre, der screenes automatisk efter ca. 6 timer (30 min pr. gitter), hvor 3-5 kvadrater i forskellige størrelser og 3-5 huller pr. kvadrat afbildes ved høj forstørrelse, så brugeren hurtigt kan bestemme prøvens egenskaber på hvert gitter og hurtigt gentage gennem prøve-/gitterforhold (figur 3). Nogle gange er sessioner mislykkede, ofte på grund af Autoscreen-målretning mod brudte firkanter, ikke fortolker store istykkelsesgradienter på tværs af gitteret eller på tværs af firkanter korrekt eller ikke identificerer huller korrekt på kulstofgitter. Derudover kan potentielle hukommelseslækager få Leginon til at gå ned på grund af overdreven hukommelsesforbrug, hvilket kan løses ved at frigøre RAM eller genstarte computeren eller forbedres ved at tilføje mere RAM til computeren.
Figur 1: Smart Leginon Autoscreen arbejdsgang. En overordnet oversigt over Smart Leginon Autoscreen-arbejdsgangen. Først oprettes en skabelonsession ved at vælge parametre for et repræsentativt gitter i den batch af gitre, der skal screenes. Opsætning af Leginon og oprettelse af en skabelonsession tager mindre end 45 minutter. For det andet er Autoscreen konfigureret til at bruge skabelonsessionsparametrene til at screene alle gitre i kassetten. Opsætning af Autoscreen tager mindre end 10 min. Endelig afslutter Autoscreen screeningssessionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Konventionel enkelt partikel cryoEM pipeline før automatiseret screening. De mest almindelige trin i den konventionelle kryoEM-pipeline med en enkelt partikel før automatiseret screening sammen med komponenter, der kan forbedres. Hvert trin er farvet for at tilnærme, hvor meget af en flaskehals trinnet er i forhold til andre. Den blå cirkulære pil repræsenterer flere feedbacksløjfer mellem de fleste trin. Gennemstrømningen på flere trin afhænger stærkt af prøven, finansieringen og forskerens placering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative Smart Leginon Autoscreen resultater. Repræsentative billeder i flere skalaer efter Smart Leginon Autoscreen-protokollen indsamlet på en TFS Krios cryoTEM med et BioQuantum-energifilter og K3-kamera. (A) Et sammensat »atlasbillede«, der viser en oversigt over et kryoEM-gitter. (B-F) Billeder i flere skalaer fra angivne steder i gitteratlasset. Billeder med lav forstørrelse i første række, billeder med medium forstørrelse i anden række og billeder med høj forstørrelse i tredje række blev hver især valgt automatisk for at få oplysninger om prøven fra tynde til tykke isfirkanter. Istykkelsen som estimeret af Leginon er vist på bunden. Skalabjælker er 500 μm i (A) og 10 μm for første række, 5 μm for anden række og 100 nm for tredje række for (B-F). Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Cheng et al.8. Klik her for at se en større version af denne figur.
| gr: Gitter | sq: Square | hln: Hul | ventilator: Autofokus | fcn: Centralt fokus | enn: Eksponering | |
| Forstørrelse | 210 | 2600 | 6700 | 120000 | 120000 | 120000 |
| Defocus | -0.0002 | -0.00015 | -0.00015 | -2 x 10-06 | -7 x 10-07 | -2,5 x 10-06 |
| Spot størrelse | 5 | 5 | 4 | 2 | 2 | 2 |
| Intensitet | 1.1 | 0.83 | 0.65 | 0.44 | 0.44 | 0.45 |
| Dimension | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 4096 x 4096 |
| Forskydning | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 512, 512 | 0, 0 |
| Indkøbskurv | 4 x 4 | 4 x 4 | 4 x 4 | 4 x 4 | 2 x 2 | 1 x 1 |
| Eksponeringstid (ms) | 200 | 500 | 500 | 500 | 500 | 1000 |
| Før eksponering(er) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Dosis (e/Å2) | -- | -- | -- | 36.5 | 36.5 | 64.7 |
| Gem rå rammer | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | Ja |
Tabel 1: Forudindstillede parametre for cryoEM-gitterscreening på Simons Electron Microscopy Center (SEMC) ved hjælp af et Glacios cryoTEM med et Falcon 3EC kamera. Parametre for hver forudindstilling, der almindeligvis anvendes på en Glacios cryoTEM med et Falcon 3EC-kamera på SEMC, vises. Forskellige mikroskoper vil have forskellige forstørrelser til rådighed, og forskellige eksperimenter vil bruge forskellige parametre såsom defokusering og eksponeringstid.
| gr: Gitter | sq: Square | hln: Hul | ventilator: Autofokus | fcn: Centralt fokus | enn: Eksponering | |
| Forstørrelse | 64 | 1700 | 2850 | 75000 | 75000 | 75000 |
| Defocus | 0 | -5 x 10-05 | -5 x 10-05 | -1 x 10-06 | -7 x 10-07 | -2 x 10-06 |
| Spot størrelse | 6 | 9 | 9 | 6 | 6 | 7 |
| Intensitet | 0.001 | 1,65 x 10-05 | 1,5 x 10-05 | 4,3 x 10-07 | 4,3 x 10-07 | 5,5 x 10-07 |
| Energifilter bredde | -- | -- | -- | 20 | 20 | 20 |
| Dimension | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 2048 x 2048 | 4096 x 4096 |
| Forskydning | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 |
| Indkøbskurv | 4 x 4 | 4 x 4 | 4 x 4 | 4 x 4 | 2 x 2 | 1 x 1 |
| Eksponeringstid (ms) | 500 | 2000 | 1000 | 500 | 300 | 8700 |
| Før eksponering(er) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Dosis (e/Å2) | -- | -- | -- | -- | -- | 47.4 |
| Gem rå rammer | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | Ja |
Tabel 2: Forudindstillede parametre for cryoEM-gitterscreening ved SEMC ved hjælp af en Krios cryoTEM med et Selectris X- og Falcon 4i-kamera. Parametre for hver forudindstilling, der almindeligvis anvendes på en Krios med et Selectris X-energifilter og Falcon 4i-kamera på SEMC, vises. Forskellige mikroskoper vil have forskellige forstørrelser til rådighed, og forskellige eksperimenter vil bruge forskellige parametre såsom defokusering og eksponeringstid.
| gr: Gitter | sq: Square | hln: Hul | ventilator: Autofokus | fcn: Centralt fokus | enn: Eksponering | |
| Forstørrelse | 1550 | 940 | 2250 | 81000 | 81000 | 81000 |
| Defocus | 0 | -5 x 10-05 | -5 x 10-05 | -1 x 10-06 | -7 x 10-07 | -2 x 10-06 |
| Spot størrelse | 4 | 8 | 7 | 6 | 6 | 6 |
| Intensitet | 0.0015 | 0.00017 | 7,3 x 10-05 | 1,3 x 10-06 | 1,3 x 10-06 | 9,2 x 10-07 |
| Energifilter bredde | -- | -- | 50 | 20 | 20 | 20 |
| Dimension | 1024 x 1024 | 1440 x 1024 | 1440 x 1024 | 1440 x 1024 | 1008 x 1008 | 5760 x 4092 |
| Forskydning | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 936, 519 | 0, 0 |
| Indkøbskurv | 4 x 4 | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 4 x 4 | 2 x 2 |
| Eksponeringstid (ms) | 250 | 600 | 600 | 500 | 500 | 2100 |
| Før eksponering(er) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Dosis (e/Å2) | -- | -- | -- | -- | -- | 51 |
| Gem rå rammer | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | Ja |
Tabel 3: Forudindstillede parametre til cryoEM-netscreening ved SEMC ved hjælp af en Krios cryoTEM med et BioQuantum- og K3-kamera. Parametre for hver forudindstilling, der almindeligvis anvendes på en Krios med et BioQuantum-energifilter og K3-kamera på SEMC, vises. Forskellige mikroskoper vil have forskellige forstørrelser til rådighed, og forskellige eksperimenter vil bruge forskellige parametre såsom defokusering og eksponeringstid.
Supplerende figur 1: Firkantede målretningsindstillinger og firkantede indstillinger for Smart Leginon. (A) Indstillinger for firkantet målretning. (B) Firkantede indstillinger. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Indstillinger for målretning af hul og indstillinger for hul for Smart Leginon. (A) Indstillinger for målretning efter hul. (B) Hulindstillinger. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Indstillinger for eksponeringsmålretning og eksponeringsindstillinger for Smart Leginon. (A) Indstillinger for målretning mod eksponering. (B) Indstillinger for eksponering. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Fokusindstillinger og indstillinger for fokussekvens for Smart Leginon. (A) Fokusindstillinger. (B) Indstillinger for fokussekvens (Defokusering1). (C) Indstillinger for fokussekvens (Defokusering2). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 5: Z_Focus indstillinger og Z_Focus Sekvensindstillinger for Smart Leginon. (A) Z_Focus indstillinger. (B) Z_Focus Sekvensindstillinger (Stage_Tilt_Rough). (C) Z_Focus Sekvensindstillinger (Stage_Tilt_Fine). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 6: Et eksempel på atlas efter opsætning af Smart Leginon Square_Targeting parametre. Blå cirkler er klatter, grønne plustegn er anskaffelsessteder, og det brune 'x' er den aktuelle sceneplacering. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 7: Et eksempel på atlas efter opsætning af Smart Leginon Hole_Targeting parametre. Lilla plusskilte er gitterplaceringer, grønne plusskilte med kasser er anskaffelsessteder, og det blå plustegn er fokusplaceringen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 8: Et eksempel på atlas efter opsætning af Smart Leginon Exposure_Targeting parametre. Blå cirkler er klatter, grønne plustegn er anskaffelsessteder, og det blå plustegn er fokusplaceringen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 9: Smart Leginon Autoscreen terminal opsætning. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 10: Smart Leginon Autoscreen gui opsætning. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
I denne protokol beskriver vi pipelinen for Smart Leginon Autoscreen og derudover grundlæggende Lemininon-brug for dem, der er nye i indsamlingssoftwaren. KryoEM med enkelt partikel er klar til at blive den mest produktive tredimensionelle (3D) proteinstrukturopløsningsteknik inden udgangen af 202417. Den enkelte partikel cryoEM-pipeline består af flere trin, der konstant optimeres for at øge datakvaliteten og gennemstrømningen. Figur 2 viser de mest almindelige trin (prøveforberedelse, gitterforberedelse, screeningstid og -indsats, indsamlingstid i høj opløsning, livebehandling og fuld efterbehandling) sammen med andre komponenter i rørledningen, der kan forbedres (adgang til screeningsmikroskop, scenehastighed og nøjagtighed, kamerahastighed og mikroskopadgang med høj opløsning). Resultater fra de fleste trin bliver feedbacksløjfer i tidligere trin (blå pile i figur 2), hvilket gør hele pipelinen meget indbyrdes afhængig. Hvert trin i figur 2 er farvet for at anslå, hvor meget af en flaskehals trinnet er i forhold til andre. Smart Leginon Autoscreen reducerer operatørens tid og kræfter til screening af 12 gitre betydeligt fra 6 timer til mindre end 10 minutter, hvilket aflaster flaskehalsen og giver mulighed for hurtigere feedback til prøve-/gitterforberedelse (figur 3).
Der er flere kritiske trin i protokollen, som er afbildet i figur 1. Det er afgørende, at det gitter, der bruges til at oprette skabelonsessionen, er repræsentativt for de resterende gitre, der skal screenes. Det er vigtigt, at Leginon husker alle indstillinger i hele opsætningsprocessen for oprettelse af en skabelonsession (blå trin i figur 1), hvilket gør det muligt at konfigurere tilbagevendende skabelonsessioner hurtigere hver gang. Når du opretter en skabelonsession, er det mest kritiske trin at konfigurere målretning mod alle forstørrelser, så parametrene og tærsklerne afspejler den forventede variation på tværs af de gitre, der skal screenes. De forskellige 'Test'-knapper giver mulighed for effektivitet i denne opsætningsproces. Under en Autoscreen-session er det vigtigt at overvåge de første par gitre i Appion for hurtigt at opdage eventuelle problemer og rette dem inde i Leginon så hurtigt som muligt.
Den typiske arbejdsgang hos SEMC er at indføre Autoscreen-data i CryoSPARC Live18 og bruge disse yderligere oplysninger til at informere feedback-sløjferne i prøve-/gitterforberedelse. Under intensive forsker-operatør cryoEM-optimeringsdage føres information om prøven og gitterforholdene tilbage til prøve- og gitterforberedelse, mens Autoscreen stadig screener gitre. Dette gør det muligt at fryse og screene flere dusin gitre pr. uge8.
Smart Leginon Autoscreen fungerer for størstedelen (80% -90%) af hullede gitre og forhold, der observeres ved SEMC. De resterende 10% -20% af gitterene inkluderer dem, der undertiden ikke fungerer godt - gitter med minimal kontrastforskel mellem huller og substrat; gitre med mindre huller og afstand (f.eks. 0,6/0,8) - og gitre, hvor målretning på tværs af flere gitre ofte er upraktisk - Spotiton/Chameleon 19,20 gitre, der består af striber af prøver på tværs af gitteret; lacey gitre. Bemærk, at den vippede gittersamling med Autoscreen er under udvikling, men endnu ikke tilgængelig. Det kan være muligt at ændre protokollen til at arbejde med Spotiton/kamæleongitter ved først at afbilde områder af striben manuelt for at bestemme smalle parametertærskler og derefter forsøge at gruppere henholdsvis større og mindre firkanter sammen i trin 2.1.7.4 og derefter vælge mål fra gruppen med is. Målet med denne ændring er at få Smart Leginon til at adskille tomme og ikke-tomme firkanter i to grupper. Hvis der findes parametre, strækker de sig muligvis ikke godt til de resterende net, der skal screenes. Det kan også være muligt at ændre protokollen, så den fungerer med blondegitter, ved at fjerne hl_finding.sh scriptet i trin 2.1.9.1 og konfigurere parametrene til at målrette mod lysere/mørkere områder efter behov. Succesraten for denne ændring kan variere fra gitter til gitter baseret på istykkelser og gittermateriale.
Fejlfinding under en Autoscreen-session er mulig og nogle gange passende. Ændringer af forudindstillede (f.eks. defokuseringsparametre) og målretningsparametre (f.eks. grænser for målretning efter hul) kan foretages under automatisk indsamling. Mens en autoskærmsession indsamles, kan en gittersession ikke annulleres, fordi den afslutter autoscreen.py. Knapperne Afbryd i målretningsnoderne kan dog bruges til at springe en hvilken som helst del af et gitter eller et helt gitter over. Lejlighedsvis kan autoscreen.py bruge for meget hukommelse og fryse, hvilket giver to muligheder: 'tving afslut' eller 'vent'. Hvis 'force quit' er valgt, afsluttes hele scriptet, hvilket kræver, at brugeren kører scriptet igen, der skal anvendes på de resterende gitre til screening. Hvis 'vent' er valgt, fortsætter scriptet, og indstillingerne kan ændres for at forhindre fremtidig frysning, f.eks. slukning af billedvisningen i eksponeringsnoden, faldende pixelstørrelse i atlasset eller kørsel af et hukommelsesklart script. Hvis programmet fryser uden at tilbyde de to muligheder, løser hukommelsesfejl muligvis ikke alene, hvilket forårsager en pause i erhvervelsen. Indstillingen 'force quit' kan være nyttig i dette tilfælde.
Smart Leginon Autoscreen bruges regelmæssigt på SEMC. Da flaskehalse i enkeltpartikelkryoEM-rørledningen fortsætter med at blive reduceret, vil kryoEM-adoption fortsætte med at stige for at hjælpe med at besvare biologiske spørgsmål. Denne protokol er et skridt i retning af at optimere hele pipelinen ved at give en klar vej til markant reduktion af feedback-sløjfer.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Noget af dette arbejde blev udført på Simons Electron Microscopy Center ved New York Structural Biology Center med støtte fra Simons Foundation (SF349247), NIH (U24 GM129539) og NY State Assembly.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | GLACIOSTEM | FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera |
| Krios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | KRIOSG4TEM | XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera |
| Leginon | Simons Electron Microscopy Center | http://leginon.org | |
| Ptolemy | Simons Machine Learning Center | https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy |
References
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. Cryo-EM grid optimization for membrane proteins. iScience. 24 (3), 102139 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Koh, A., et al. Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope. Journal of Visualized Experiments. 181, 63519 (2022).
- Cheng, A., et al. Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon. IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).
- Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy. IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).
- Bepler, T., et al. Smart data collection for CryoEM. Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913 (2022).
- Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope. eLife. 11, e80047 (2022).
- Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. Smart EPU: SPA Getting Intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).
- Fan, Q., et al. CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection. arXiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging. bioRxiv. Biophysics. , (2022).
- Lander, G. C., et al. Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- Russo, C. J. The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , https://chanzuckerberg.com/science/meetings/hardware-frontiers-cryoet-workshop/ (2023).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. 168, 62271 (2021).
- Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).
