Summary
Cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) multi-grid screening is vaak een vervelend proces dat uren aandacht vraagt. Dit protocol laat zien hoe je een standaard Leginon collectie instelt en Smart Leginon Autoscreen om dit proces te automatiseren. Dit protocol kan worden toegepast op de meeste cryoEM holleyfolieroosters.
Abstract
Vooruitgang in cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) -technieken in het afgelopen decennium heeft structurele biologen in staat gesteld om routinematig macromoleculaire eiwitcomplexen op te lossen tot bijna atomaire resolutie. De algemene workflow van de gehele cryoEM-pijplijn omvat het herhalen tussen monstervoorbereiding, cryoEM-rastervoorbereiding en monster-/rasterscreening voordat wordt overgegaan tot het verzamelen van gegevens met hoge resolutie. Itereren tussen monster-/roostervoorbereiding en screening is doorgaans een groot knelpunt voor onderzoekers, aangezien elk iteratief experiment moet optimaliseren voor monsterconcentratie, buffercondities, roostermateriaal, rastergatgrootte, ijsdikte en eiwitdeeltjesgedrag in het ijs, naast andere variabelen. Bovendien, zodra deze variabelen naar tevredenheid zijn bepaald, variëren rasters die onder identieke omstandigheden zijn opgesteld sterk in de vraag of ze klaar zijn voor gegevensverzameling, dus aanvullende screeningsessies voorafgaand aan het selecteren van optimale rasters voor gegevensverzameling met hoge resolutie worden aanbevolen. Dit monster-/roostervoorbereidings- en screeningproces neemt vaak enkele tientallen roosters en dagen tijd van de operator aan de microscoop in beslag. Bovendien is het screeningproces beperkt tot de beschikbaarheid van de operator/microscoop en de toegankelijkheid van de microscoop. Hier laten we zien hoe u Leginon en Smart Leginon Autoscreen kunt gebruiken om het grootste deel van de cryoEM-rasterscreening te automatiseren. Autoscreen combineert machine learning, computer vision-algoritmen en algoritmen voor het hanteren van microscopen om de noodzaak van constante handmatige invoer door de operator te elimineren. Autoscreen kan autonoom rasters laden en afbeelden met beeldvorming op meerdere schalen met behulp van een geautomatiseerd sample-uitwisselingscassettesysteem, wat resulteert in onbemande rasterscreening voor een hele cassette. Als gevolg hiervan kan de tijd van de operator voor het screenen van 12 roosters worden teruggebracht tot ~10 minuten met Autoscreen in vergelijking met ~6 uur met eerdere methoden die worden belemmerd door hun onvermogen om rekening te houden met grote variabiliteit tussen roosters. Dit protocol introduceert eerst de basisconfiguratie en functionaliteit van Leginon en demonstreert vervolgens de Autoscreen-functionaliteit stap voor stap vanaf het maken van een sjabloonsessie tot het einde van een geautomatiseerde screeningsessie met 12 rasters.
Introduction
Cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje (cryoEM) maakt het mogelijk om de structuurstructuur van gezuiverde macromoleculaire complexen met bijna atomaire resolutie te bepalen. Een cryoEM-experiment met één deeltje vereist slechts een of twee goed gekozen roosters die zijn geselecteerd uit een veel grotere set rasters met verschillende monster- en roosteromstandigheden. Microscoopscreening om deze roosters te onderzoeken, omvat het afbeelden van elk raster met verschillende vergrotingen om te bepalen welk raster voldoet aan de belangrijkste vereisten voor het verzamelen van gegevens met hoge resolutie, waaronder ijsdikte, voldoende gebieden voor volledige gegevensverzameling, eiwitzuiverheid, eiwitconcentratie, eiwitstabiliteit en minimale voorkeursoriëntatieproblemen1. Optimaliseren voor deze belangrijke vereisten omvat vaak feedback tussen screening met de microscoop en bereidingsomstandigheden zoals eiwitproductie, bufferselectie, potentiële reinigingsmiddelen en roostertype 2,3,4 (Figuur 1). Conventionele rasterscreening wordt handmatig of semi-handmatig uitgevoerd met software zoals Leginon5, SerialEM6 en EPU7. Conventionele screening vereist dat de microscoopoperator uren bij de microscoop doorbrengt om verschillende roosters te screenen, wat een aanzienlijk knelpunt creëert in de workflow met één deeltje met hoge resolutie door de operator bezig te houden met routinematige bewerkingen in plaats van met monster-/rasteroptimalisatie.
Eerder zijn Smart Leginon Autoscreen en de onderliggende machine learning-software, Ptolemaeus, geïntroduceerd en zijn hun onderliggende methoden en algoritmen samen met voorbeelden beschreven 8,9. Verschillende andere softwarepakketten zijn in staat tot of werken aan volledig geautomatiseerde multi-grid screening10, waaronder SmartScope11, Smart EPU12 en CryoRL13,14. Om het screeningsknelpunt aan te pakken, stelt Smart Leginon de gebruiker in staat om eerst screeningparameters in te stellen in een sjabloonmicroscoopsessie en vervolgens de parameters van die sjabloonsessie te gebruiken als sjabloon om de volledige cassette met rasters in de microscoop-autoloader te screenen. Al het handmatige werk tijdens het screenen van cassettes wordt geëlimineerd, waardoor de feedbacklus voor optimalisatie aanzienlijk efficiënter kan verlopen.
In dit protocol wordt de volledige Smart Leginon Autoscreen-workflow beschreven, zodat de lezer zelfstandig volledig geautomatiseerde multi-grid cryoEM-screening kan uitvoeren. Voor degenen die nieuw zijn bij Leginon, beschrijft het eerste deel van het protocol conventioneel Leginon-gebruik. Deze kennis is samengesteld uit meerdere jaren ervaring met verschillende autoloader-microscopen, waarop vervolgens wordt voortgebouwd in het volgende Smart Leginon-gedeelte van het protocol. Aanvullende instructievideo's zijn te vinden op https://memc.nysbc.org.
Protocol
Om dit protocol, weergegeven in figuur 2, te volgen, moet Leginon 3.6+ worden geïnstalleerd op de microscoopcomputer en op een extra Linux-werkstation, en Ptolemaeus moet worden geïnstalleerd op het Linux-werkstation. Dit protocol is in de loop der jaren ontwikkeld met behulp van Thermo Fisher Scientific (TFS) Glacios- en Krios-microscopen. Dit protocol gaat ervan uit dat de lezer Leginon, Appion15, de bijbehorende database, microscoopkalibraties al heeft geconfigureerd, directe uitlijningen op de microscoop heeft uitgevoerd en twee Leginon-applicaties heeft opgezet: één voor standaard verzameling van enkele deeltjes en één voor verzameling van afzonderlijke deeltjes met Ptolemaeus. Informatie over het instellen van Leginon vindt u hier: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual. Informatie over het opzetten van Ptolemaeus binnen Leginon is hier beschikbaar: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening. Download Leginon van http://leginon.org en Ptolemaeus van https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy. Leginon is gelicentieerd onder de Apache-licentie, versie 2.0, en Ptolemaeus is gelicentieerd onder CC BY-NC 4.0.
1. Gebruik van Leginon
- Start Leginon
- Sluit alle Leginon-clients op de Windows-microscoopcomputer en open deze vervolgens opnieuw. Open in het Linux-werkstation een terminalvenster en typ start-leginon.py of de juiste alias van het systeem voor het starten van Leginon.
- Selecteer in het nieuwe Leginon Setup-venster Een nieuwe sessie maken en klik op Volgende.
- Selecteer het project in de vervolgkeuzelijst en klik op Volgende.
- Laat de naam zoals deze is, selecteer de juiste houder voor de opstelling van de microscoop en klik op Volgende.
- Voer voor de beschrijving relevante informatie in, zoals de naam van de microscoop, de beschrijving van het raster/monster en de beschrijving van het experiment, en klik vervolgens op Volgende.
- Zorg ervoor dat voor de afbeeldingsmap het juiste bestandssysteem is geselecteerd en dat het volledige pad geschikt is voor het opslaan van afbeeldingen, en klik vervolgens op Volgende.
- Klik onder Verbinding maken met clients op Bewerken. Selecteer in het vervolgkeuzemenu alle computers die moeten worden aangesloten en klik op de knop + voor elke computer en klik vervolgens op OK en Volgende.
- Voer de juiste C2-diafragmagrootte in en klik op Volgende. Deze waarde is te vinden in het tabblad Openingen van de TFS TUI-software.
- Leginon-interface
- Selecteer Toepassing op de werkbalk en klik op Uitvoeren.
- Selecteer de juiste toepassing in het vervolgkeuzemenu (klik indien nodig op Alles weergeven ). Stel de hoofdcamera in op de Leginon-computer en het bereik en de camera op die respectievelijke computer en klik vervolgens op Uitvoeren. De linkerkant van het hoofdvenster van Leginon wordt gevuld met knooppunten.
OPMERKING: In het linkerdeelvenster worden alle Leginon-knooppunten weergegeven. De groene knooppunten van het camerapictogram zijn de afbeeldingen die worden opgeslagen: Raster, Vierkant, Gat en Belichting. Knooppunten met het doelteken zijn afbeeldingen met een lagere vergroting voor het richten op de afbeeldingen met een hogere vergroting. De paarse cameraknooppunten zijn de knooppunten die zijn geprogrammeerd om eucentrische z-hoogte en eucentrische focus te vinden. Daarnaast zijn er knooppunten om de nulverliespiek uit te lijnen, de buffercyclus te bewaken, het vullen van vloeibare stikstof te bewaken, versterkingscorrectiebeelden te verzamelen, de ijsdikte (IceT) te berekenen en door het raster te navigeren door verschillende vergrotingen met behulp van fase- en beeldverschuiving. - Beheer van voorinstellingen
- Klik op de Presets_Manager node. Klik in dat knooppunt op het onderste pictogram voor het importeren van voorinstellingen of op het pictogram erboven om een nieuwe voorinstelling te maken op basis van de huidige staat van de microscoop.
- Als op het onderste pictogram wordt geklikt, wordt een venster Voorinstellingen importeren geopend. Selecteer de juiste TEM en digitale camera, klik vervolgens op Zoeken en selecteer de meest recente sessie met de gewenste voorinstellingen. Markeer alle gewenste voorinstellingen en klik op Importeren en klik vervolgens op Gereed.
OPMERKING: Het knooppunt Presets Manager zou nu alle geïmporteerde en gemaakte voorinstellingen moeten weergeven. Het wordt aanbevolen om voorinstellingen te hebben voor verschillende vergrotingen en scherpstellen, waaronder gr: Rastervergroting, sq: Vierkante vergroting, hln: Gatvergroting, ventilator: Autofocus, fcn: Centrale focus, enn: Belichtingsvergroting (achterste 'n' verwijst naar nanoprobe). Typische vooraf ingestelde parameters voor elke vergroting worden weergegeven in tabel 1, tabel 2 en tabel 3. Merk op dat dit protocol een C2-diafragma gebruikt van 70 μm voor de Glacios, 50 μm voor de Krios met een Selectris X en Falcon 4i, en 100 μm voor de Krios met een BioQuantum met een K3.
- Navigatie en eucentrische hoogte
- Om vertrouwd te raken met het besturen van de microscoop via Leginon en om de z-hoogte van het raster in te stellen, gaat u naar het navigatieknooppunt, selecteert u de gr-preset bovenaan en klikt u op de rode pijl naar rechts om de vooraf ingestelde instellingen naar de microscoop te sturen. De microscoop zou na 1-2 s moeten worden bijgewerkt. Eenmaal bijgewerkt, klikt u op de cameraknop aan de rechterkant om een afbeelding te verkrijgen.
- Selecteer met behulp van het cursorgereedschap een rastervierkant voor waar u het werkgebied wilt verplaatsen. Klik op de vierkante vergroting en vervolgens op de rode pijl om naar de microscoop te sturen en klik op de cameraknop om een afbeelding te maken.
- Ga naar het Z_Focus knooppunt en klik op de knop Doel simuleren bovenaan in het midden van de knoppen. Terwijl beelden worden verzameld voor scherpstelling op het gebied van kantelen, schakelt u over naar de correlatieweergave en kijkt u naar de piek om er zeker van te zijn dat deze zich in de hoek van het correlatiebeeld bevindt. Zodra het scherpstellen is voltooid, zorgt u ervoor dat de werkruimte is ingesteld op de z-hoogte van het raster.
- Coma correctie
OPMERKING: In deze subsectie wordt ervan uitgegaan dat er al directe uitlijningen zijn uitgevoerd en dat er geen comacorrecties zijn uitgevoerd.- Navigeer naar een gebied van het raster dat duidelijke Thon-ringen produceert, zoals koolstofsubstraat.
NOTITIE: Een kruisrooster kan worden gebruikt als het verzamelen op een gouden rooster moet gebeuren. - Zorg er in de Beam_Tilt_Image instellingen voor dat de Presets Order alleen fcn bevat met vier kantelrichtingen onder een hoek van 0.005 radialen.
- Klik op Doel simuleren om een Zemlin-tableau te maken. Klik op Tableau aan de linkerkant van het hoofdvenster om het tableau te bekijken.
- Corrigeer voor coma door de linker en rechter Fouriertransformaties met elkaar te vergelijken en de bovenste en onderste Fouriertransformaties met elkaar. Als de paren afbeeldingen niet identiek zijn, klik dan eerst op het cursorpictogram rechts van de afbeeldingsaanpassingen, klik vervolgens iets uit het midden in de Tableau-afbeelding in de richting van het verschil en wacht tot een nieuwe set Fouriertransformaties is verzameld. Herhaal dit totdat de Fouriertransformaties identiek zijn.
OPMERKING: Elke Tableau-klik duurt enkele seconden en er mogen gedurende deze tijd geen extra klikken worden gemaakt.
- Navigeer naar een gebied van het raster dat duidelijke Thon-ringen produceert, zoals koolstofsubstraat.
- Referenties verkrijgen
OPMERKING: Sla dit gedeelte over als de camera automatische hardwarereferenties heeft.- Verzend in het navigatieknooppunt een voorinstelling met een lage vergroting, zoals gr, en navigeer naar een gebied waar het straalpad niet wordt belemmerd.
- Controleer of de werkgebiedpositie zich op een locatie bevindt die niet wordt belemmerd door het straalpad door een beeld met gemiddelde vergroting te maken met behulp van de voorinstelling sq of hln .
- Stuur de voorinstelling met hoge vergroting naar de microscoop.
- Selecteer in de instellingen van het correctieknooppunt de juiste instrumentinformatie en stel de cameraconfiguratie in zodat deze overeenkomt met de verzamelingsinstellingen.
- Verzamel een donker referentiebeeld door de kolomkleppen op de microscoop te sluiten, selecteer vervolgens in het Correctieknooppunt Donker en Beide kanalen in de vervolgkeuzemenu's bovenaan en klik op de knop Camera verkrijgen aan de rechterkant.
- Als u klaar bent, selecteert u Helder in het vervolgkeuzemenu en klikt u op Acquire. Leginon opent de kolomkleppen automatisch.
- Controleer of de versterking correct is verzameld door Gecorrigeerd te selecteren in het vervolgkeuzemenu, op Verkrijgen te klikken en de resulterende afbeelding te bekijken.
- Referentiebeeld ijsdikte
- Als de microscoop een energiefilter heeft, vink dan in de instellingen van het IceT-knooppunt Afbeelding van ijsdikte verzamelen aan, voer 395 in voor het vrije pad Gemiddeld en vul de rest van de waarden voor de opstelling in.
- Als de microscoop geen energiefilter heeft, stuurt u in het navigatieknooppunt de enn-voorinstelling naar de microscoop en klikt u op Acquire. Noteer de gemiddelde pixelwaarde aan de linkerkant. Vink in de instellingen van het IceT-knooppunt de optie Bereken de ijsdikte op basis van diafragmabeperkte verstrooiing aan, voer 1055 in voor de ALS-coëfficiënt en de gemeten gemiddelde pixelwaarde.
OPMERKING: De waarden 395 en 1055 zijn bepaald voor respectievelijk de TFS Krios en Glacios, zoals eerder beschreven16, en moeten mogelijk opnieuw worden gekalibreerd voor verschillende microscoopconfiguraties.
- Kalibratie van beelddoses
- Selecteer in de Preset_Manager de enn-voorinstelling en klik op de cameraknop (Dosisbeeld voor de geselecteerde voorinstelling verkrijgen). Controleer de afgemeten dosis op de bodem. Als deze waarde dicht bij de verwachte waarde ligt (meestal tussen 30 en 70), klikt u op JA.
- Vooraf ingestelde uitlijningen
- Controleer in de Preset_Manager alle voorinstellingen voor hoge vergroting (enn, fcn en ventilator) om er zeker van te zijn dat de beeldverschuiving en straalverschuiving 0, 0 zijn.
- Navigeer op de microscoopcomputer naar een koolstofgebied.
- Maak op de Leginon-computer in het navigatieknooppunt een afbeelding met de gr-voorinstelling .
- Zoek een interessant object en ga naar die locatie met behulp van het cursorgereedschap.
- Verkrijg een afbeelding met de hln-voorinstelling en verplaats een uniek deel van dat interessante object naar het midden met behulp van het cursorgereedschap.
- Verkrijg een afbeelding met de enn-voorinstelling en verplaats deze naar hetzelfde unieke deel van het object van interesse met behulp van het cursorgereedschap.
- Selecteer beeldverschuiving in het vervolgkeuzemenu en verkrijg een afbeelding met de hln-voorinstelling. Verplaats naar hetzelfde unieke deel van het object dat u interesseert met het cursorgereedschap.
- Selecteer in de Presets_Manager de hln-voorinstelling , klik op deknop Instellen en importeer de beeldverschuiving uit Navigatie door op de groene pijl naar links naast de waarden voor beeldverschuiving te klikken.
- Herhaal stap 2.9.7 en 2.9.8 voor de sq- en gr-voorinstellingen .
- Raster atlas
- Sluit op de microscoopcomputer de kolomkleppen en trek de objectiefopening in. Ga naar het Grid_Targeting knooppunt. Wijzig in de instellingen het label van het raster. Kies de gewenste straal van de atlas (de maximale straal is 0,0009 m). Klik op OK. Klik vervolgens bovenaan op de knop Atlascalculator berekenen en klik op de groene knop Afspelen ('Doelen indienen').
- In het Square_Targeting knooppunt worden de rasterafbeeldingen verzameld en aan elkaar genaaid om een atlas te vormen. Zoom in en uit met behulp van het vervolgkeuzemenu en pas het contrast en de helderheid aan. Gebruik de schuifbalken om door het raster te bewegen.
- Zodra de atlas is verzameld, plaatst u desgewenst de objectiefopening.
- Als de microscoop een energiefilter heeft, selecteert u een referentiedoel in het midden van een gebroken vierkant, drukt u op de afspeelknop en gaat u verder met ZLP-uitlijning in de volgende subsectie. Sla anders de ZLP-uitlijningsstap over.
- ZLP-uitlijning
- Selecteer in de instellingen van het Align_ZLP knooppunt de fasepositien om het referentiedoel te verplaatsen en selecteer vooraf ingestelde manager als de verhuizer. Schakel de bypass-conditioner uit en druk vervolgens op OK.
NOTITIE: ZLP-uitlijning moet nu zo worden geconfigureerd dat de microscoop periodiek naar het referentiedoel beweegt en de ZLP-uitlijningsroutine van de camera uitvoert. ZLP-heruitlijningstijden van 30 min en 60 min zijn doorgaans veilig voor respectievelijk Gatan BioQuantum en TFS Selectris X energiefilters. Deze waarden variëren afhankelijk van de omstandigheden van het energiefilter, waaronder constante vochtigheid, constante temperatuur, isolatie van elektromagnetische velden en trillingsisolatie.
- Selecteer in de instellingen van het Align_ZLP knooppunt de fasepositien om het referentiedoel te verplaatsen en selecteer vooraf ingestelde manager als de verhuizer. Schakel de bypass-conditioner uit en druk vervolgens op OK.
- Instellen van targeting op gatensjabloon
- Selecteer in het Square_Targeting knooppunt meerdere acquisitiedoelen en druk vervolgens op Afspelen.
- Zorg ervoor dat in de instellingen van het Hole_Targeting knooppunt Gebruikersverificatie van geselecteerde doelen toestaan en Doelen in wachtrij staan zijn aangevinkt. Controleer ook Sla nu geautomatiseerde gatenzoeker over. Klik op Toepassen en vervolgens op OK.
- Gebruik in het hoofdvenster Ctrl-Shift-klik met de rechtermuisknop om alle doelen te verwijderen. Selecteer de acquisitiecursor en plaats de doelen. Selecteer de focuscursor en plaats een focusdoel tussen de acquisitiedoelen. Klik op Afspelen.
- Voor de volgende Hole_Targeting afbeelding schakelt u de automatische holefinder overslaan uit in de instellingen en klikt u vervolgens op Toepassen en OK. Verwijder de automatische doelen met Ctrl-Shift-klik met de rechtermuisknop.
- Selecteer het liniaalgereedschap en meet de diameter over een gat. Wijzig in de sjablooninstellingen de uiteindelijke sjabloondiameter in de gemeten gatdiameter. Wijzig de diameter van de originele sjabloon niet. Klik op Test. Als er geen heldere pieken in het midden van elk gat zijn, vergroot dan de uiteindelijke sjabloondiameter. Als u klaar bent, klikt u op OK.
- Kies in de instellingen voor Drempelwaarde een waarde voor A waarmee de gaten afzonderlijk worden gesegmenteerd wanneer op Test wordt geklikt. Klik op OK als u tevreden bent.
- Voer in de Blobs-instellingen de waarden in en klik op Testen. De waarde Max. blobs is 1, dus er wordt slechts één blob weergegeven. Klik op OK.
- Gebruik in de roosterinstellingen het liniaalgereedschap om de afstand tussen twee gaten te meten (hart op hart). Voer de waarde in Spatiëring in en klik op Test. De ene klodder verandert in een roosterpunt. Klik op OK.
- Ga naar acquisitie-instellingen en optimaliseer de acquisitiedoelen met behulp van drempelwaarden voor ijsdikte en de knop Targeting testen. Krijg informatie over de ijsdikte door de muisaanwijzer op de roosterpunten te plaatsen.
- Als de acquisitiedoelen niet bevredigend zijn, gebruikt u het liniaalgereedschap om de afstand en hoek van het roosterpunt tot de gewenste locatie voor een acquisitiedoel te meten. Verwijder de vorige Acquisition Target Template-punten . Klik op Auto Fill, zet 4 voor het aantal doelen en verander de straal en hoek naar de gemeten waarden. Klik op OK. Vink IJsdiktedrempel toepassen op acquisitiedoelen op basis van sjablonen aan.
- Als u tevreden bent met de roosterpunten en de ijsdiktedrempels, klikt u op de knop Doelen indienen .
- Herhaal een van de bovenstaande stappen indien nodig voor elk vierkant dat is geselecteerd. Dien de hele wachtrij in met de knop Wachtrijdoelen indienen zodra alle vierkante doelen zijn ingediend.
- Leginon zal beginnen met het scherpstellen en in beeld brengen van elke set doelen. Zorg er in de Z_Focus knoop voor dat de eucentrische hoogte goed is gevonden.
- Instelling van targeting op blootstellingssjabloon
- In het knooppunt Belichtingstargeting worden afbeeldingen van gatvergroting weergegeven. Gebruik Ctrl-Shift en klik met de rechtermuisknop om de automatische doelen te verwijderen.
- Meet de diameter van een gat met het liniaalgereedschap. Voer in de sjablooninstellingen de diameter in Uiteindelijke sjabloondiameter in en klik op Testen. Een piek zou nu in het midden van elke hole moeten zijn. Pas indien nodig de diameterwaarden aan.
- Pas in de drempelwaarde-instellingen de A-waarde aan totdat de gebinariseerde testafbeelding alleen witte gebieden toont waar gaten zich bevinden.
- Klik in de Blobs-instellingen op Testen. Er zou één blob per gesegmenteerd gat moeten verschijnen. Vergroot de rand om de blobs van de randen van de afbeelding te verwijderen, indien gewenst.
- Klik in de roosterinstellingen op Testen. Pas parameters aan totdat alle blobs zijn veranderd in roosterpunten. Klik op OK.
- Klik op het liniaalgereedschap en meet de afstand tussen twee roosterpunten. Wijzig in de roosterinstellingen Afstand naar die afstand.
- Beweeg de muisaanwijzer over elk roosterpunt om de gemiddelde intensiteit, gemiddelde dikte, standaarddeviatie-intensiteit en standaarddeviatiedikte te zien. Noteer de intensiteiten voor elk roosterpunt en gebruik deze om de gewenste ijsdikteparameters in te stellen in de acquisitie-instellingen.
- Meet de afstand en hoek van één roosterpunt tot het midden van 4 gaten met het liniaalgereedschap. Verwijder in de acquisitie-instellingen de huidige focusdoelen. Klik op Automatisch vullen en wijzig de straal en hoek in de gemeten waarden. Klik op Targeting testen, klik op OK en klik op Doelen verzenden.
OPMERKING: Leginon vindt eucentrische scherpstelling (Focusknooppunt) en verzamelt belichtingen, die verschijnen in het Belichtingsknooppunt. - Zodra alle doelen in beeld zijn gebracht, gaat u naar de Exposure_Targeting knoop om de volgende afbeelding van de hole te zien. Schakel in de instellingen het vinkje uit voor Toestaan voor gebruikersverificatie van geselecteerde doelen. Schakel ook het vinkje uit Doelen in de wachtrij zetten en Geautomatiseerde holefinder overslaan. Klik op OK en klik op Doelen indienen.
OPMERKING: Leginon verzamelt automatisch afbeeldingen op basis van de hierboven geconfigureerde instellingen. Bekijk de afbeeldingen en metadata in Appion.
- Wijzigingen kunnen worden aangebracht tijdens het automatisch verzamelen. U kunt bijvoorbeeld op elk gewenst moment het bereik voor onscherpte van de verzameling wijzigen door de enn-voorinstelling in de Preset_Manager te bewerken.
- Als het verzamelen moet worden gestopt, beëindigt u de wachtrij door te klikken op de knoppen Afbreken en Wachtrij afbreken in de knooppunten Gat en Belichting.
- Zodra de verzameling is voltooid, gaat u naar Toepassing en klikt u op Doden, vervolgens naar Bestand en klikt u op Afsluiten.
2. Smart Leginon Autoscreen-gebruik
- Een Smart Leginon Template-sessie maken
- Volg de instructies in hoofdstuk 1 om Leginon te starten.
- Ga naar Toepassing en klik op Uitvoeren. Selecteer in het venster Toepassing uitvoeren de Ptolemaeus-toepassing (selecteer indien nodig Alles weergeven ). Stel de hoofdcamera in op de Leginon-computer en de scoop en camera op die respectievelijke computer.
- Importeer in de Preset_Manager voorinstellingen zoals beschreven in stap 1.2.3.
- Configureer knooppuntinstellingen.
- Zorg ervoor dat in de instellingen van het Square_Targeting knooppunt Doelen sorteren op kortste pad en Automatische targeting inschakelen zijn aangevinkt (aanvullende afbeelding 1A).
- Zorg ervoor dat in de instellingen voor het vierkante knooppunt Wachten tot het knooppunt de afbeelding heeft verwerkt , is aangevinkt. Voeg de Square preset toe aan de lijst aan de rechterkant van het vervolgkeuzemenu als deze er nog niet is. Vink in Geavanceerde instellingen deze diafragma's aan tijdens het maken van de beeldvorming en zorg ervoor dat de waarden voor de twee diafragma's correct zijn (aanvullende afbeelding 1B).
- Schakel in de instellingen van het Hole_Targeting knooppunt het selectievakje Toestaan voor gebruikersverificatie van geselecteerde doelen in. Verwijder het vinkje bij Doelen in de wachtrij zetten en Geautomatiseerde gatenzoeker overslaan (aanvullende afbeelding 2A).
- Vink in de instelling Hole-knooppunt Wachten tot een node de afbeelding heeft verwerkt aan en de voorinstelling Hole in de lijst aan de rechterkant staat. Vink in Geavanceerde instellingen deze diafragma's aan tijdens het maken van de beeldvorming en zorg ervoor dat de waarden voor de twee diafragma's correct zijn (aanvullende afbeelding 2B).
- Schakel in de instellingen van het Exposure_Targeting knooppunt de optie Toestaan voor gebruikersverificatie van geselecteerde doelen in. Verwijder het vinkje bij Doelen in de wachtrij zetten en Geautomatiseerde gatenzoeker overslaan (aanvullende afbeelding 3A).
- Zorg er in de instellingen voor Belichtingsknooppunt voor dat Wachten tot een knooppunt het beeld heeft verwerkt niet is aangevinkt, de voorinstelling Belichting wordt aan de rechterkant weergegeven en vink in Geavanceerde instellingen deze diafragma's instellen tijdens het maken van de beeldvorming aan en zorg ervoor dat de waarden voor de twee diafragma's correct zijn (aanvullende afbeelding 3B).
- Zorg er in de instellingen van het focusknooppunt voor dat Wachten tot een knooppunt het beeld heeft verwerkt niet is aangevinkt, de voorinstelling voor automatisch scherpstellen aan de rechterkant wordt vermeld en de gewenste nauwkeurigheid van de autofocus is ingesteld op 4 x 10-6 m (aanvullende afbeelding 4A).
- Schakel in de focusvolgorde van het focusknooppunt (naast de instellingenknop) slechts twee stappen voor automatisch scherpstellen van de bundel in (aanvullende afbeelding 4B,C).
- Zorg er in de instellingen van Z_Focus knooppunt voor dat Wachten tot een knooppunt het beeld heeft verwerkt niet is aangevinkt, de voorinstelling Gat wordt aan de rechterkant vermeld en De gewenste nauwkeurigheid van de autofocus is 5 x 10-5 m (aanvullende afbeelding 5A).
- Schakel in de focusvolgorde van het Z_Focus knooppunt slechts twee stappen voor het kantelen van de fase met een lage vergroting in (aanvullende afbeelding 5B,C).
- Bepaal de z-hoogte van het rooster zoals beschreven in stap 1.2.4.
- Verzamel een atlas zoals beschreven in stap 1.2.10.
- Stel parameters voor de vierkante zoeker in.
- Zodra de atlas is verzameld, zal Ptolemaeus vierkanten in de Square_Targeting knoop vinden. Elk vierkant toont een blauwe cirkel, een blob genaamd. Wanneer Leginon met de muis over elke klodder gaat, rapporteert hij hun grootte zoals berekend door Ptolemaeus. Noteer de grootste en kleinste klodders.
- Wijzig in de instellingen voor Drempelwaarden het minimale en maximale filterbereik om gewenste vierkanten op te nemen en ongewenste vierkanten uit te sluiten.
- Klik op de knop Vierkanten zoeken in de bovenste werkbalk. Pas het filterbereik aan totdat Find Squares goed is gericht.
- Kies in de acquisitie-instellingen waarden voor Max . aantal doelen en Aantal te bemonsteren doelgroepen. Deze parameters bepalen hoeveel vierkanten en groepen vierkanten worden getarget.
- Als u tevreden bent met de parameters, klikt u op de knop Afspelen . Een voorbeeld van een atlas na de installatie is weergegeven in aanvullende figuur 6.
- Stel de parameters van de gatzoeker in.
- Gebruik in het Hole_Targeting knooppunt het liniaalgereedschap om de diameter van een gat te meten.
- Voer in de sjablooninstellingen de diameter in Uiteindelijke sjabloondiameter in en klik op Testen. Pas de diameter aan totdat alle gaten helderwitte pieken in het midden hebben.
- Klik in de instellingen voor Drempelwaarde op Testen. Pas de A-waarde aan totdat de gebinariseerde afbeelding alleen witte gebieden toont waar zich gaten bevinden.
- Kies in de instellingen voor Blobs om randdoelen uit te sluiten door de liniaal te gebruiken om een minimale afstand tot de rand te bepalen en die waarde in te voeren. Blobs kunnen worden gefilterd op grootte, rondheid en gewenst aantal. Plaats de muisaanwijzer op blobs om hun waarden weer te geven. Klik op Test om de huidige waarden te inspecteren.
- Voer in de roosterinstellingen de straal van de gaten en de afstand tussen de gaten in (gebruik het meetgereedschap) en klik vervolgens op de knop 42 om de referentie-intensiteitswaarde van een vacuümgebied te meten (leeg gat of gebroken steunfolie).
- Schakel in de acquisitie-instellingen Subset van de acquisitiedoelen gebruiken in en stel de maximale waarde van de steekproef in op een klein getal, zoals 2. Stel een breed scala aan ijsdiktegemiddelden en standaarddeviaties in (meet deze waarden door met de muis over doelen te gaan). Klik op Targeting testen om de doelselectie willekeurig te maken op basis van de bovenstaande waarden.
- Klik op de knop Afspelen als u tevreden bent met alle instellingen. Leginon voert fase Z_Focus uit en verzamelt het eerste doelwit. Een voorbeeldafbeelding na de installatie wordt weergegeven in aanvullende afbeelding 7.
- Stel parameters voor blootstellingstargeting in.
- Stel in de Hole-instellingen het Shell-script in op het hl_finding.sh scriptpad in de Ptolemaeus-installatie. Stel de minimumscore in die moet worden geaccepteerd op ≤0. Voer de straal van de gaten in (gebruik het meetinstrument) en klik vervolgens op de knop 42 om de referentie-intensiteitswaarde van een vacuümgebied te meten (leeg gat of gebroken steunfolie). Klik op Test om het rooster van gaten te vinden.
- Schakel in acquisitie-instellingen Subset van de acquisitiedoelen gebruiken in en stel de maximale waarde van de steekproef in op een klein getal, zoals 4, om te verzamelen op een subset van gaten voor screening. Stel een breed scala aan ijsdiktegemiddelden en standaarddeviaties in (meet deze waarden door met de muis over doelen te gaan).
- Klik op de knop Afspelen als u tevreden bent met alle instellingen. Leginon voert eucentrische scherpstelling uit en verzamelt sterk vergrote beelden, die te zien zijn in het belichtingsknooppunt . Een voorbeeldafbeelding na de installatie wordt weergegeven in aanvullende afbeelding 8.
- Bekijk de volgende Exposure_Targeting afbeelding om te zien of de bovenstaande instellingen nog steeds voldoende zijn. Als u tevreden bent, haalt u het vinkje weg voor Toestaan voor gebruikersverificatie van geselecteerde doelen in de instellingen Belichtingstargeting en Holetargeting.
OPMERKING: De screening zou nu onbeheerd moeten worden uitgevoerd voor het huidige net. Deze sessie wordt gebruikt als sjabloonsessie voor alle rasters.
- Zodra het raster klaar is met screenen, klikt u op Bestand > Afsluiten om Leginon te sluiten.
- Smart Leginon Autoscreen instellen
- Voer in een terminalvenster de autoscreen.py van Smart Leginon uit.
- Selecteer gui, voer een door komma's gescheiden lijst met rastersleuven in om te screenen, voer volledig in voor de workflow, voer de naam van de sjabloonsessie in om nieuwe sessies op te baseren (dit is te vinden in Appion imageviewer) en voer de z-hoogtewaarde van de sjabloonsessie in (aanvullende afbeelding 9).
- Er wordt een gui geopend waarmee men de sessienaam voor elk raster kan invoeren en hun respectievelijke projectassociaties kan selecteren (aanvullende figuur 10).
OPMERKING: Smart Leginon Autoscreen gebruikt nu de instellingen van de sjabloonsessie om elk raster automatisch te screenen en zonder toezicht tussen rasters te schakelen. - Volg mee tijdens de collectie in Leginon, Appion en de microscoopcomputer, of laat de microscoop volledig onbeheerd achter.
OPMERKING: Zodra alle roosters zijn afgeschermd, sluit Smart Leginon de kolomkleppen op de microscoop.
Representative Results
Volgens het protocol kunnen cryoEM-screeningsessies automatisch en met succes worden uitgevoerd voor de meeste (80%-90%) van de holle roosters en omstandigheden. Erzijn al eerder 8,9 voorbeelden en experimenten gepresenteerd om de verwachte resultaten van succesvolle Smart Leginon Autoscreen-sessies aan te tonen. Een succesvolle Autoscreen-sessie begint met ~10 minuten instellen en resulteert gewoonlijk in een volledige cassette van 12 rasters die automatisch worden gescreend na ongeveer 6 uur (30 minuten per raster) waar 3-5 vierkanten van verschillende grootte en 3-5 gaten per vierkant worden afgebeeld met een hoge vergroting, waardoor de gebruiker snel de kenmerken van het monster op elk raster kan bepalen en snel kan itereren door de monster-/rasteromstandigheden (Figuur 3). Af en toe zijn sessies niet succesvol, meestal omdat Autoscreen zich richt op gebroken vierkanten, grote ijsdiktegradiënten over het raster of over vierkanten niet goed interpreteert, of gaten in koolstofrasters niet goed identificeert. Bovendien kunnen mogelijke geheugenlekken ervoor zorgen dat Leginon crasht als gevolg van overmatig geheugengebruik, wat kan worden opgelost door RAM vrij te maken of de computer opnieuw op te starten, of te verbeteren door meer RAM aan de computer toe te voegen.
Figuur 1: Smart Leginon Autoscreen workflow. Een overzicht op hoog niveau van de Smart Leginon Autoscreen-workflow. Eerst wordt een sjabloonsessie gemaakt door parameters te selecteren voor een representatief raster in de batch rasters die moeten worden gescreend. Het instellen van Leginon en het maken van een sjabloonsessie duurt minder dan 45 minuten. Ten tweede is Autoscreen ingesteld om de parameters van de sjabloonsessie te gebruiken om alle rasters in de cassette te screenen. Het instellen van Autoscreen duurt minder dan 10 minuten. Ten slotte beëindigt Autoscreen de screeningsessie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Conventionele cryoEM-pijpleiding met één deeltje voorafgaand aan geautomatiseerde screening. De meest voorkomende stappen in de conventionele cryoEM-pijplijn met één deeltje voorafgaand aan geautomatiseerde screening, samen met componenten die kunnen worden verbeterd. Elke stap is gekleurd om bij benadering aan te geven hoeveel van een knelpunt de stap is ten opzichte van andere. De blauwe cirkelvormige pijl vertegenwoordigt verschillende feedbacklussen tussen de meeste stappen. De doorvoer in verschillende stappen is sterk afhankelijk van de steekproef, de financiering en de locatie van de onderzoeker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve Smart Leginon Autoscreen-resultaten. Representatieve beelden op meerdere schalen volgens het Smart Leginon Autoscreen-protocol, verzameld op een TFS Krios cryoTEM met een BioQuantum-energiefilter en K3-camera. (A) Een samengestelde 'atlas'-afbeelding met een overzicht van een cryoEM-raster. (B-F) Afbeeldingen op meerdere schalen vanaf aangegeven locaties in de rasteratlas. Beelden met een lage vergroting in de eerste rij, beelden met een gemiddelde vergroting in de tweede rij en beelden met een hoge vergroting in de derde rij werden elk automatisch geselecteerd om informatie over het monster te verkrijgen van dunne tot dikke ijsvierkanten. De ijsdikte zoals geschat door Leginon is op de bodem weergegeven. Schaalbalken zijn 500 μm in (A) en 10 μm voor de eerste rij, 5 μm voor de tweede rij en 100 nm voor de derde rij voor (B-F). Dit cijfer is aangepast met toestemming van Cheng et al.8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| gr: Raster | sq: Vierkant | hln: Gat | ventilator: Autofocus | fcn: Centraal | enn: Belichting | |
| Vergroting | 210 | 2600 | 6700 | 120000 | 120000 | 120000 |
| Onscherpte | -0.0002 | -0.00015 | -0.00015 | -2 x 10-06 | -7 x 10-07 | -2,5 x 10-06 |
| Grootte van de vlek | 5 | 5 | 4 | 2 | 2 | 2 |
| Intensiteit | 1.1 | 0.83 | 0.65 | 0.44 | 0.44 | 0.45 |
| Dimensie | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 4096 x 4096 cm |
| Afstand | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 512, 512 | 0, 0 |
| Bakken | 4 x 4 | 4 x 4 | 4 x 4 | 4 x 4 | 2 x 2 | 1 x 1 |
| Belichtingstijd (ms) | 200 | 500 | 500 | 500 | 500 | 1000 |
| Voorbelichting(en) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Dosis (e/Å2) | -- | -- | -- | 36.5 | 36.5 | 64.7 |
| Onbewerkte frames opslaan | Nee | Nee | Nee | Nee | Nee | Ja |
Tabel 1: Vooraf ingestelde parameters voor cryoEM-rasterscreening in Simons Electron Microscopy Center (SEMC) met behulp van een Glacios cryoTEM met een Falcon 3EC-camera. Parameters voor elke preset die vaak wordt gebruikt op een Glacios cryoTEM met een Falcon 3EC-camera bij SEMC worden weergegeven. Verschillende microscopen hebben verschillende vergrotingen beschikbaar en verschillende experimenten gebruiken verschillende parameters, zoals onscherpte en belichtingstijd.
| gr: Raster | sq: Vierkant | hln: Gat | ventilator: Autofocus | fcn: Centraal | enn: Belichting | |
| Vergroting | 64 | 1700 | 2850 | 75000 | 75000 | 75000 |
| Onscherpte | 0 | -5 x 10-05 | -5 x 10-05 | -1 x 10-06 | -7 x 10-07 | -2 x 10-06 |
| Grootte van de vlek | 6 | 9 | 9 | 6 | 6 | 7 |
| Intensiteit | 0.001 | 1,65 x 10-05 | 1,5 x 10-05 | 4,3 x 10-07 | 4,3 x 10-07 | 5,5 x 10-07 |
| Breedte energiefilter | -- | -- | -- | 20 | 20 | 20 |
| Dimensie | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 2048 x 2048 | 4096 x 4096 cm |
| Afstand | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 |
| Bakken | 4 x 4 | 4 x 4 | 4 x 4 | 4 x 4 | 2 x 2 | 1 x 1 |
| Belichtingstijd (ms) | 500 | 2000 | 1000 | 500 | 300 | 8700 |
| Voorbelichting(en) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Dosis (e/Å2) | -- | -- | -- | -- | -- | 47.4 |
| Onbewerkte frames opslaan | Nee | Nee | Nee | Nee | Nee | Ja |
Tabel 2: Vooraf ingestelde parameters voor cryoEM-rasterscreening bij SEMC met behulp van een Krios cryoTEM met een Selectris X- en Falcon 4i-camera. Parameters voor elke preset die vaak wordt gebruikt op een Krios met een Selectris X-energiefilter en Falcon 4i-camera bij SEMC worden weergegeven. Verschillende microscopen hebben verschillende vergrotingen beschikbaar en verschillende experimenten gebruiken verschillende parameters, zoals onscherpte en belichtingstijd.
| gr: Raster | sq: Vierkant | hln: Gat | ventilator: Autofocus | fcn: Centraal | enn: Belichting | |
| Vergroting | 1550 | 940 | 2250 | 81000 | 81000 | 81000 |
| Onscherpte | 0 | -5 x 10-05 | -5 x 10-05 | -1 x 10-06 | -7 x 10-07 | -2 x 10-06 |
| Grootte van de vlek | 4 | 8 | 7 | 6 | 6 | 6 |
| Intensiteit | 0.0015 | 0.00017 | 7,3 x 10-05 | 1,3 x 10-06 | 1,3 x 10-06 | 9,2 x 10-07 |
| Breedte energiefilter | -- | -- | 50 | 20 | 20 | 20 |
| Dimensie | 1024 x 1024 | 1440 x 1024 | 1440 x 1024 | 1440 x 1024 | 1008 x 1008 | 5760 x 4092 cm |
| Afstand | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 936, 519 | 0, 0 |
| Bakken | 4 x 4 | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 4 x 4 | 2 x 2 |
| Belichtingstijd (ms) | 250 | 600 | 600 | 500 | 500 | 2100 |
| Voorbelichting(en) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Dosis (e/Å2) | -- | -- | -- | -- | -- | 51 |
| Onbewerkte frames opslaan | Nee | Nee | Nee | Nee | Nee | Ja |
Tabel 3: Vooraf ingestelde parameters voor cryoEM-rasterscreening bij SEMC met behulp van een Krios cryoTEM met een BioQuantum- en K3-camera. Parameters voor elke preset die vaak wordt gebruikt op een Krios met een BioQuantum-energiefilter en K3-camera bij SEMC worden weergegeven. Verschillende microscopen hebben verschillende vergrotingen beschikbaar en verschillende experimenten gebruiken verschillende parameters, zoals onscherpte en belichtingstijd.
Aanvullende afbeelding 1: Square Targeting-instellingen en Square-instellingen voor Smart Leginon. (A) Instellingen voor vierkante targeting. (B) Vierkante instellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 2: Hole Targeting-instellingen en Hole-instellingen voor Smart Leginon. (A) Instellingen voor holetargeting. (B) Gaten instellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 3: Instellingen voor belichtingstargeting en belichtingsinstellingen voor Smart Leginon. (A) Instellingen voor belichtingstargeting. (B) Belichtingsinstellingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 4: Scherpstelinstellingen en scherpstelvolgorde-instellingen voor Smart Leginon. (A) Scherpstelinstellingen. (B) Instellingen scherpstelvolgorde (Onscherpte1). (C) Instellingen scherpstelvolgorde (Onscherpte2). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 5: Z_Focus instellingen en Z_Focus sequentie-instellingen voor Smart Leginon. (A) Z_Focus instellingen. (B) Z_Focus Sequentie-instellingen (Stage_Tilt_Rough). (C) Z_Focus Sequentie-instellingen (Stage_Tilt_Fine). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 6: Een voorbeeldatlas na het instellen van Smart Leginon Square_Targeting parameters. Blauwe cirkels zijn klodders, groene plustekens zijn acquisitielocaties en de bruine 'x' is de huidige podiumlocatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 7: Een voorbeeldatlas na het instellen van Smart Leginon Hole_Targeting parameters. Paarse plustekens zijn roosterlocaties, groene plusborden met vakken zijn acquisitielocaties en het blauwe plusteken is de focuslocatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 8: Een voorbeeldatlas na het instellen van Smart Leginon Exposure_Targeting parameters. Blauwe cirkels zijn klodders, groene plustekens zijn acquisitielocaties en het blauwe plusteken is de focuslocatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 9: Smart Leginon Autoscreen-terminalconfiguratie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 10: Smart Leginon Autoscreen gui setup. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
In dit protocol beschrijven we de pijplijn voor Smart Leginon Autoscreen, en daarnaast het basisgebruik van Leginon voor degenen die nieuw zijn in de verzamelsoftware. CryoEM met één deeltje staat op het punt om tegen eind 2024 de meest productieve driedimensionale (3D) techniek voor het oplossen van eiwitstructuren te worden17. De cryoEM-pijplijn met één deeltje bestaat uit verschillende stappen die voortdurend worden geoptimaliseerd om de datakwaliteit en doorvoer te verhogen. Figuur 2 toont de meest voorkomende stappen (monstervoorbereiding, rastervoorbereiding, screeningtijd en -inspanning, verzameltijd met hoge resolutie, live verwerking en volledige nabewerking) samen met andere componenten van de pijplijn die kunnen worden verbeterd (toegang tot de screeningmicroscoop, snelheid en nauwkeurigheid van de fase, camerasnelheid en toegang tot microscoop met hoge resolutie). De resultaten van de meeste stappen worden feedbackloops naar eerdere stappen (blauwe pijlen in figuur 2), waardoor de hele pijplijn sterk van elkaar afhankelijk is. Elke stap in figuur 2 is gekleurd om bij benadering aan te geven hoeveel van een knelpunt de stap is ten opzichte van andere. Smart Leginon Autoscreen vermindert de tijd en moeite van de operator voor het screenen van 12 roosters aanzienlijk van 6 uur tot minder dan 10 minuten, waardoor dat knelpunt wordt verlicht en snellere feedback naar monster-/roostervoorbereiding mogelijk is (Figuur 3).
Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol, weergegeven in figuur 1. Het is van cruciaal belang dat het raster dat wordt gebruikt voor het maken van de sjabloonsessie representatief is voor de resterende rasters die moeten worden gescreend. Belangrijk is dat Leginon alle instellingen onthoudt in het hele installatieproces voor het maken van een sjabloonsessie (blauwe stappen in afbeelding 1), waardoor terugkerende sjabloonsessies elke keer sneller kunnen worden ingesteld. Bij het maken van een sjabloonsessie is de meest kritieke stap het instellen van targeting op alle vergrotingen, zodat de parameters en drempelwaarden de verwachte variatie weerspiegelen over de rasters die moeten worden gescreend. De verschillende 'Test'-knoppen zorgen voor efficiëntie in dit installatieproces. Tijdens een Autoscreen-sessie is het van cruciaal belang om de eerste paar rasters in Appion te bewaken om eventuele problemen snel op te sporen en zo snel mogelijk in Leginon op te lossen.
De typische workflow bij SEMC is om Autoscreen-gegevens in CryoSPARC Live18 in te voeren en deze aanvullende informatie te gebruiken om de feedbacklussen in de monster-/rastervoorbereiding te informeren. Tijdens intensieve cryoEM-optimalisatiedagen van onderzoeker-operator wordt informatie over het monster en de roosteromstandigheden teruggekoppeld naar de monster- en roostervoorbereiding, terwijl Autoscreen nog steeds roosters screent. Hierdoor kunnen enkele tientallen roosters per week8 worden ingevroren en gezeefd.
Smart Leginon Autoscreen werkt voor de meerderheid (80%-90%) van de holle roosters en omstandigheden die bij SEMC worden waargenomen. De overige 10%-20% van de roosters omvat roosters die soms niet goed werken - roosters met minimaal contrastverschil tussen gaten en substraat; rasters met kleinere gaten en tussenruimte (bijv. 0,6/0,8) - en rasters waarbij het vaak onpraktisch is om op meerdere rasters te richten - Spotiton/Chameleon19,20 rasters die bestaan uit strepen van monster over het raster; kanten roosters. Merk op dat de collectie gekantelde rasters met Autoscreen in ontwikkeling is, maar nog niet beschikbaar is. Het is mogelijk om het protocol aan te passen om met Spotiton/Chameleon-rasters te werken door eerst handmatig gebieden van de streep in beeld te brengen om smalle parameterdrempels te bepalen, vervolgens te proberen grotere en kleinere vierkanten te groeperen, respectievelijk in stap 2.1.7.4, en vervolgens doelen te selecteren uit de groep met ijs. Het doel van deze aanpassing is om Smart Leginon lege en niet-lege vierkanten in twee groepen te laten scheiden. Als er parameters worden gevonden, strekken deze zich mogelijk niet goed uit tot de resterende roosters die moeten worden afgeschermd. Het kan ook mogelijk zijn om het protocol aan te passen om met kantrasters te werken door het hl_finding.sh-script in stap 2.1.9.1 te verwijderen en de parameters naar wens te configureren om lichtere/donkere gebieden te targeten. Het slagingspercentage van deze modificatie kan variëren van raster tot raster op basis van ijsdiktes en roostermateriaal.
Het oplossen van problemen tijdens een Autoscreen-sessie is mogelijk en soms geschikt. Wijzigingen in vooraf ingestelde (bijv. onscherpte) en targetingparameters (bijv. Hole Targeting-drempels) kunnen worden aangebracht tijdens het automatisch verzamelen. Terwijl een Autoscreen-sessie wordt verzameld, kan een rastersessie niet worden geannuleerd omdat deze autoscreen.py beëindigt. De knoppen Afbreken in de doelknooppunten kunnen echter worden gebruikt om een deel van een raster of een heel raster over te slaan. Af en toe kan autoscreen.py te veel geheugen gebruiken en bevriezen, waardoor er twee opties zijn: 'geforceerd stoppen' of 'wachten'. Als 'geforceerd stoppen' is geselecteerd, wordt het hele script beëindigd, waardoor de gebruiker het script opnieuw moet uitvoeren om te worden toegepast op de resterende rasters voor screening. Als 'wachten' is geselecteerd, gaat het script verder en kunnen de instellingen worden gewijzigd om toekomstige bevriezing te voorkomen, bijvoorbeeld door de beeldweergave in het Exposure-knooppunt uit te schakelen, de pixelgrootte in de atlas te verkleinen of een script uit te voeren dat het geheugen wist. Als het programma vastloopt zonder de twee opties aan te bieden, lossen geheugenfouten mogelijk niet vanzelf op, waardoor de acquisitie wordt onderbroken. De optie 'geforceerd stoppen' kan in dit geval handig zijn.
Smart Leginon Autoscreen wordt regelmatig gebruikt bij SEMC. Naarmate knelpunten in de cryoEM-pijplijn met één deeltje verder worden verminderd, zal de acceptatie van cryoEM blijven toenemen om biologische vragen te helpen beantwoorden. Dit protocol is een stap in de richting van het optimaliseren van de hele pijplijn door een duidelijk pad te bieden voor het aanzienlijk verminderen van feedbacklussen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Een deel van dit werk werd uitgevoerd in het Simons Electron Microscopy Center van het New York Structural Biology Center, met steun van de Simons Foundation (SF349247), NIH (U24 GM129539) en NY State Assembly.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | GLACIOSTEM | FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera |
| Krios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | KRIOSG4TEM | XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera |
| Leginon | Simons Electron Microscopy Center | http://leginon.org | |
| Ptolemy | Simons Machine Learning Center | https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy |
References
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. Cryo-EM grid optimization for membrane proteins. iScience. 24 (3), 102139 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Koh, A., et al. Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope. Journal of Visualized Experiments. 181, 63519 (2022).
- Cheng, A., et al. Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon. IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).
- Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy. IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).
- Bepler, T., et al. Smart data collection for CryoEM. Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913 (2022).
- Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope. eLife. 11, e80047 (2022).
- Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. Smart EPU: SPA Getting Intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).
- Fan, Q., et al. CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection. arXiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging. bioRxiv. Biophysics. , (2022).
- Lander, G. C., et al. Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- Russo, C. J. The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , https://chanzuckerberg.com/science/meetings/hardware-frontiers-cryoet-workshop/ (2023).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. 168, 62271 (2021).
- Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).
