Summary
Kryoelektronmikroskopi (cryoEM) multi-grid screening är ofta en tråkig process som kräver timmar av uppmärksamhet. Detta protokoll visar hur du ställer in en standard Leginon-kollektion och Smart Leginon Autoscreen för att automatisera denna process. Detta protokoll kan tillämpas på de flesta cryoEM håliga foliegaller.
Abstract
Framsteg inom kryoelektronmikroskopi (cryoEM) under det senaste decenniet har gjort det möjligt för strukturbiologer att rutinmässigt lösa makromolekylära proteinkomplex till nästan atomär upplösning. Det allmänna arbetsflödet för hela kryoEM-pipelinen innebär att man itererar mellan provberedning, kryoEM-rutnätsberedning och prov-/rutnätsscreening innan man går vidare till högupplöst datainsamling. Iterering mellan prov-/rutnätsberedning och screening är vanligtvis en stor flaskhals för forskare, eftersom varje iterativt experiment måste optimera för bland annat provkoncentration, buffertförhållanden, rutnätsmaterial, rutnätshålsstorlek, istjocklek och proteinpartiklars beteende i isen. Dessutom, när dessa variabler väl har bestämts på ett tillfredsställande sätt, varierar rutnät som förberetts under identiska förhållanden kraftigt i fråga om huruvida de är redo för datainsamling, så ytterligare screeningsessioner innan man väljer optimala rutnät för högupplöst datainsamling rekommenderas. Denna prov-/gallerberedning och screeningprocess förbrukar ofta flera dussin rutnät och dagar av operatörstid vid mikroskopet. Dessutom är screeningprocessen begränsad till operatörens/mikroskopets tillgänglighet och mikroskopets tillgänglighet. Här visar vi hur man använder Leginon och Smart Leginon Autoscreen för att automatisera majoriteten av cryoEM-rutnätsscreening. Autoscreen kombinerar maskininlärning, algoritmer för datorseende och algoritmer för hantering av mikroskop för att ta bort behovet av konstant manuell operatörsinmatning. Autoscreen kan autonomt ladda och avbilda rutnät med flerskalig avbildning med hjälp av ett automatiserat provbyteskassettsystem, vilket resulterar i obevakad rutnätsscreening för en hel kassett. Som ett resultat av detta kan operatörstiden för screening av 12 rutnät minskas till ~10 minuter med Autoscreen jämfört med ~6 timmar med tidigare metoder som hämmas av deras oförmåga att ta hänsyn till hög variabilitet mellan näten. Detta protokoll introducerar först grundläggande Leginon-installation och funktionalitet, och demonstrerar sedan Autoscreen-funktionalitet steg för steg från skapandet av en mallsession till slutet av en automatiserad screeningsession med 12 rutnät.
Introduction
Kryoelektronmikroskopi (cryoEM) med en partikel möjliggör strukturbestämning med nära atomär upplösning av renade makromolekylära komplex. Ett kryoEM-experiment med en partikel kräver bara ett eller två väl valda rutnät som valts ut från en mycket större uppsättning rutnät med varierande prov- och rutnätsförhållanden. Mikroskopscreening för att undersöka dessa rutnät innebär att man avbildar varje rutnät vid flera förstoringar för att avgöra vilket rutnät som uppfyller de viktigaste kraven för högupplöst datainsamling, inklusive istjocklek, tillräckliga områden för fullständig datainsamling, proteinrenhet, proteinkoncentration, proteinstabilitet och minimala föredragna orienteringsproblem1. Optimering för dessa nyckelkrav involverar ofta återkoppling mellan screening vid mikroskopet och beredningsförhållanden såsom proteinproduktion, buffertval, potentiella rengöringsmedel och gallertyp 2,3,4 (Figur 1). Konventionell gallersiktning utförs manuellt eller halvmanuellt med programvara som Leginon5, SerialEM6 och EPU7. Konventionell screening kräver att mikroskopoperatören tillbringar timmar vid mikroskopet för att screena flera rutnät, vilket skapar en betydande flaskhals i arbetsflödet för högupplösta enstaka partiklar genom att sysselsätta operatören med utantilloperationer snarare än provtagnings-/rutnätsoptimering.
Tidigare har Smart Leginon Autoscreen och den underliggande programvaran för maskininlärning, Ptolemaios, introducerats, och deras underliggande metoder och algoritmer tillsammans med exempel har beskrivits 8,9. Flera andra mjukvarupaket är antingen kapabla till eller arbetar mot helautomatisk multi-grid screening10, inklusive SmartScope11, Smart EPU12 och CryoRL13,14. För att ta itu med flaskhalsen för screening tillåter Smart Leginon användaren att först ställa in screeningparametrar i en mallmikroskopsession och sedan använda den mallsessionens parametrar som en mall för att screena hela kassetten med rutnät i mikroskopets autoladdare. Allt manuellt arbete under kassettsiktningen elimineras, vilket gör att optimeringsåterkopplingsslingan kan fortskrida betydligt mer effektivt.
I detta protokoll beskrivs hela Smart Leginon Autoscreen-arbetsflödet så att läsaren kan utföra helautomatisk multi-grid cryoEM-screening självständigt. För de som är nya på Leginon beskriver det första avsnittet i protokollet konventionell Leginon-användning. Denna kunskap består av flera års erfarenhet av flera autoloader-mikroskop, som sedan byggs vidare på i den efterföljande Smart Leginon-delen av protokollet. Ytterligare instruktionsvideor finns på https://memc.nysbc.org.
Protocol
För att följa detta protokoll, som visas i figur 2, måste Leginon 3.6+ installeras på mikroskopdatorn och på ytterligare en Linux-arbetsstation, och Ptolemaios måste installeras på Linux-arbetsstationen. Detta protokoll har utvecklats under flera år med hjälp av Thermo Fisher Scientific (TFS) Glacios och Krios mikroskop. Detta protokoll förutsätter att läsaren redan har konfigurerat Leginon, Appion15, den tillhörande databasen, mikroskopkalibreringar, utfört direkta justeringar på mikroskopet och har ställt in två Leginon-applikationer: En för standardinsamling av enstaka partiklar och en för insamling av enstaka partiklar med Ptolemaios. Information om hur du installerar Leginon finns här: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual. Information om hur du ställer in Ptolemaios i Leginon finns här: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening. Ladda ner Leginon från http://leginon.org och Ptolemaios från https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy. Leginon är licensierat under Apache-licensen, version 2.0, och Ptolemaios är licensierat under CC BY-NC 4.0.
1. Användning av Leginon
- Starta Leginon
- Stäng alla Leginon-klienter på mikroskopets Windows-dator och öppna den sedan igen. I Linux-arbetsstationen öppnar du ett terminalfönster och skriver start-leginon.py eller systemets lämpliga alias för att starta Leginon.
- I det nya fönstret Leginon Setup väljer du Skapa en ny session och klickar på Nästa.
- Välj projektet i listrutan och klicka på Nästa.
- Lämna namnet som det är, välj rätt hållare för mikroskopets inställning och klicka på Nästa.
- För beskrivningen anger du relevant information, t.ex. mikroskopets namn, beskrivning av rutnät/prov och experimentbeskrivning, och klickar sedan på Nästa.
- För bildkatalogen kontrollerar du att rätt filsystem är markerat och att den fullständiga sökvägen är lämplig för att spara bilder och klickar sedan på Nästa.
- Under Anslut till klienter klickar du på Redigera. I rullgardinsmenyn väljer du alla datorer som ska anslutas och klickar på +-knappen för var och en och klickar sedan på OK och Nästa.
- Mata in rätt C2-bländarstorlek och klicka på Nästa. Det här värdet finns på fliken Öppningar i TFS TUI-programvaran.
- Leginon gränssnitt
- Välj Program i verktygsfältet och klicka på Kör.
- Välj rätt program från rullgardinsmenyn (klicka på Visa alla om det behövs). Ställ in main på Leginon-datorn och kikarsiktet och kameran på respektive dator och klicka sedan på Kör. Den vänstra sidan av Leginons huvudfönster kommer att fyllas med noder.
OBS: Den vänstra panelen visar alla Leginon-noder. De gröna kameraikonnoderna är de bilder som kommer att sparas: Rutnät, Kvadrat, Hål och Exponering. Noder med måltecknet är bilder med lägre förstoring för att rikta in sig på bilderna med högre förstoring. De lila kameranoderna är de noder som är programmerade för att hitta eucentrisk z-höjd och eucentrisk fokus. Dessutom finns det noder för att justera nollförlusttoppen, övervaka buffertcykeln, övervaka fyllning av flytande kväve, samla in förstärkningskorrigeringsbilder, beräkna istjocklek (IceT) och navigera i rutnätet genom olika förstoringar med hjälp av scen- och bildförskjutning. - Hanterare för förinställningar
- Klicka på noden Presets_Manager. I den noden klickar du på den nedre ikonen för att importera förinställningar eller ikonen ovanför den för att skapa en ny förinställning från mikroskopets aktuella tillstånd.
- Om du klickar på den nedre ikonen öppnas ett fönster för importförinställningar . Välj rätt TEM och digitalkamera, klicka sedan på Sök och välj den senaste sessionen med önskade förinställningar. Markera alla önskade förinställningar och klicka på Importera och klicka sedan på Klar.
NODEN Förinställningshanteraren bör nu visa en lista över alla importerade och skapade förinställningar. Det rekommenderas att ha förinställningar för flera förstoringar och fokusering, inklusive gr: Rutnätsförstoring, kvadrat: Fyrkantsförstoring, hln: Hålförstoring, fläkt: Autofokus, fcn: Central fokus, enn: Exponeringsförstoring (efterföljande 'n' hänvisar till nanosond). Typiska förinställda parametrar för varje förstoring visas i Tabell 1, Tabell 2 och Tabell 3. Observera att detta protokoll använder en C2-bländare på 70 μm för Glacios, 50 μm för Krios med en Selectris X och Falcon 4i och 100 μm för Krios med en BioQuantum med en K3.
- Navigering och eucentrisk höjd
- För att bli bekant med att styra mikroskopet genom Leginon och för att ställa in z-höjden på rutnätet, gå till navigationsnoden, välj gr-förinställningen högst upp och klicka på den röda pilen till höger för att skicka de förinställda inställningarna till mikroskopet. Mikroskopet bör uppdateras efter 1-2 s. När du har uppdaterat klickar du på kameraknappen till höger för att hämta en bild.
- Använd markörverktyget och välj en rutnätsfyrkant dit scenen ska flyttas. Klicka på sq-förstoringen och sedan på den röda pilen för att skicka till mikroskopet och klicka på kameraknappen för att få en bild.
- Gå till noden Z_Focus och klicka på knappen Simulera mål längst upp i mitten av knapparna. Medan bilder samlas in för scenlutningsfokusering växlar du till korrelationsvyn och tittar på toppen för att säkerställa att den är i hörnet av korrelationsbilden. När fokuseringen är klar, se till att scenen är inställd på rutnätets z-höjd.
- Korrigering av koma
OBS: Detta underavsnitt förutsätter att direkta justeringar redan har utförts och att komakorrigeringar inte har utförts.- Navigera till ett område i rutnätet som producerar tydliga Thon-ringar, till exempel kolsubstrat.
OBS: Ett korsgaller kan användas om uppsamling ska ske på ett guldgaller. - I inställningarna för Beam_Tilt_Image ser du till att förinställningsordningen endast innehåller fcn med fyra lutningsriktningar i en vinkel på 0,005 radianer.
- Klicka på Simulera mål för att skapa en Zemlin-tablå. Klicka på Tableau till vänster i huvudfönstret för att visa tablån.
- Korrigera för koma genom att jämföra vänster och höger Fouriertransformer med varandra och de övre och nedre Fouriertransformerna med varandra. Om bildparen inte är identiska klickar du först på markörikonen till höger om bildjusteringarna, klickar sedan något utanför mitten i Tableau-bilden i skillnadens riktning och väntar på att en ny uppsättning Fourier-transformeringar ska samlas in. Upprepa tills Fouriertransformerna är identiska.
Varje Tableau-klick tar flera sekunder att slutföra och inga ytterligare klick bör göras under denna tid.
- Navigera till ett område i rutnätet som producerar tydliga Thon-ringar, till exempel kolsubstrat.
- Få referenser
OBS: Hoppa över det här avsnittet om kameran har automatiska hårdvarureferenser.- I noden Navigering skickar du en förinställning med låg förstoring, till exempel gr, och navigerar till ett område där det inte finns något hinder för strålbanan.
- Bekräfta att stage position är på en plats som inte hindras av strålvägen genom att ta en bild med medelstor förstoring med hjälp av sq eller hln förinställningen.
- Skicka förinställningen för hög förstoring till mikroskopet.
- I inställningarna för noden Korrigering väljer du rätt instrumentinformation och ställer in kamerakonfigurationen så att den matchar samlingsinställningarna.
- Samla in en mörk referensbild genom att stänga kolonnventilerna på mikroskopet, välj sedan Mörk och Båda kanalerna i noden Korrigering från rullgardinsmenyerna högst upp och klicka på knappen Hämta kamera till höger.
- När du är klar väljer du Bright från rullgardinsmenyn och klickar på Förvärva. Leginon öppnar kolonnventilerna automatiskt.
- Kontrollera att förstärkningen har samlats in korrekt genom att välja Korrigerad i listrutan, klicka på Hämta och observera den resulterande bilden.
- Referensbild för istjocklek
- Om mikroskopet har ett energifilter, markera Samla in bild av istjocklek i inställningarna för IceT-noden, ange 395 för den genomsnittliga fria vägen och fyll i resten av värdena för inställningen.
- Om mikroskopet inte har något energifilter skickar du enn-förinställningen till mikroskopet i noden Navigering och klickar på Förvärva. Anteckna värdet för medelpixel på vänster sida. I inställningarna för IceT-noden, markera Beräkna istjocklek från bländarbegränsad spridning, ange 1055 som ALS-koefficient och det uppmätta genomsnittliga pixelvärdet.
OBS: Värdena 395 och 1055 bestämdes för TFS Krios respektive Glacios, som beskrivits tidigare16, och kan behöva kalibreras om för olika mikroskopkonfigurationer.
- Kalibrering av bilddos
- I Preset_Manager väljer du enn-förinställningen och klickar på kameraknappen (Hämta dosbild för den valda förinställningen). Kontrollera den uppmätta dosen på undersidan. Om det ligger nära det förväntade värdet (vanligtvis mellan 30 och 70) klickar du på JA.
- Förinställda justeringar
- I Preset_Manager, kontrollera alla förinställningar för hög förstoring (enn, fcn och fläkt) för att se till att bildförskjutningen och strålförskjutningen är 0, 0.
- Navigera till ett kolområde på mikroskopdatorn.
- På Leginon-datorn i noden Navigering hämtar du en bild med gr-förinställningen.
- Hitta ett objekt av intresse och gå till den platsen med hjälp av markörverktyget.
- Hämta en bild med hln-förinställningen och flytta en unik del av det intressanta objektet till mitten med hjälp av markörverktyget.
- Hämta en bild med enn-förinställningen och flytta den till samma unika del av objektet av intresse med hjälp av markörverktyget.
- Välj bildförskjutning från rullgardinsmenyn och skaffa en bild med hln-förinställningen. Flytta till samma unika del av objektet av intresse med markörverktyget.
- I Presets_Manager väljer du hln-förinställningen , klickar påknappen s ettings och importerar bildförskjutningen från Navigation genom att klicka på den vänstra gröna pilen bredvid bildförskjutningsvärdena .
- Upprepa steg 2.9.7 och 2.9.8 för förinställningarna sq och gr .
- Rutnät atlas
- Stäng kolonnventilerna på mikroskopdatorn och dra tillbaka objektivöppningen. Gå till noden Grid_Targeting. I inställningarna ändrar du rutnätets etikett. Välj önskad radie för atlasen (den maximala radien är 0,0009 m). Klicka på OK. Klicka sedan på knappen Beräkna atlaskalkylator högst upp och klicka på den gröna Play-knappen ('Skicka mål').
- I noden Square_Targeting samlas rutnätsbilderna in och sammanfogas för att bilda en atlas. Zooma in och ut med rullgardinsmenyn och justera kontrast och ljusstyrka. Använd rullningslisterna för att flytta i rutnätet.
- När atlasen har samlats in, sätt in objektivbländaren om så önskas.
- Om mikroskopet har ett energifilter, välj ett referensmål i mitten av en trasig fyrkant, tryck på Play-knappen och fortsätt med ZLP-inriktning i följande underavsnitt. Annars hoppar du över ZLP-justeringssteget.
- ZLP-anpassning
- I inställningarna för Align_ZLP nod väljer du stage position för att flytta referensmålet och väljer förinställningshanterare som flyttare. Avmarkera bypass-conditioner och tryck sedan på OK.
OBS: ZLP-inriktning bör nu konfigureras så att mikroskopet med jämna mellanrum flyttas till referensmålet och utför kamerans ZLP-justeringsrutin. ZLP-justeringstider på 30 minuter och 60 minuter är vanligtvis säkra för Gatan BioQuantum respektive TFS Selectris X-energifilter. Dessa värden varierar beroende på energifiltrets förhållanden, inklusive jämn luftfuktighet, jämn temperatur, elektromagnetisk fältisolering och vibrationsisolering.
- I inställningarna för Align_ZLP nod väljer du stage position för att flytta referensmålet och väljer förinställningshanterare som flyttare. Avmarkera bypass-conditioner och tryck sedan på OK.
- Inställning av inriktning på hålmall
- I noden Square_Targeting väljer du flera förvärvsmål och trycker sedan på Spela upp.
- I inställningarna för Hole_Targeting noder kontrollerar du att Tillåt användarverifiering av valda mål och Köa upp mål är markerade. Kontrollera också Hoppa över automatisk hålsökare för tillfället. Klicka på Verkställ och sedan på OK.
- I huvudfönstret använder du Ctrl-Skift-högerklick för att ta bort alla mål. Välj exponeringsmarkören och placera målen. Välj fokusmarkören och placera ett fokusmål mellan exponeringsmålen. Klicka på Spela upp.
- För nästa Hole_Targeting bild avmarkerar du Hoppa över automatisk hålsökare i inställningarna och klickar sedan på Verkställ och OK. Ta bort de automatiska målen med Ctrl-Skift-högerklick.
- Välj linjalverktyget och mät diametern över ett hål. I Mallinställningar ändrar du den slutliga malldiametern till den uppmätta håldiametern. Ändra inte den ursprungliga malldiametern. Klicka på Testa. Om ljusa toppar inte finns i mitten av varje hål, öka den slutliga malldiametern. När du är klar klickar du på OK.
- I inställningarna för Tröskelvärde väljer du ett värde för A som segmenterar hålen individuellt när du klickar på Test . Klicka på OK när du är nöjd.
- I inställningarna för blobar anger du värdena och klickar på Testa. Värdet för maximalt antal blobar är 1, så endast en blob visas. Klicka på OK.
- I gitterinställningarna använder du linjalverktyget för att mäta avståndet mellan två hål (centrum till centrum). Ange värdet i Avstånd och klicka på Testa. Den ena blobben förvandlas till en gitterpunkt. Klicka på OK.
- Gå till exponeringsinställningar och optimera exponeringsmålen med hjälp av tröskelvärden för istjocklek och knappen Testmål. Få information om istjocklek genom att hålla muspekaren över gitterpunkterna.
- Om exponeringsmålen inte är tillfredsställande använder du linjalverktyget för att mäta avståndet och vinkeln från gitterpunkten till önskad plats för ett förvärvsmål. Ta bort de tidigare punkterna för mall för förvärvsmål . Klicka på Autofyll, sätt 4 för antalet mål och ändra radien och vinkeln till de uppmätta värdena. Klicka på OK. Markera Tillämpa tröskelvärde för istjocklek på mallkonvolverade förvärvsmål.
- När du är nöjd med gitterpunkterna och tröskelvärdena för istjocklek klickar du på knappen Skicka mål .
- Upprepa något av ovanstående steg efter behov för varje ruta som har valts. Skicka hela kön med knappen Skicka köade mål när alla fyrkantiga mål har skickats.
- Leginon kommer att börja fokusera och avbilda varje uppsättning mål. I noden Z_Focus kontrollerar du att den eucentriska höjden hittas korrekt.
- Inriktning för exponeringsmall Inställning av exponeringsmall
- I noden Exponeringsmål visas bilder med hålförstoring. Använd Ctrl-Skift-högerklicka för att ta bort de automatiska målen.
- Mät diametern på ett hål med linjalverktyget. I mallinställningarna anger du diametern i Slutlig malldiameter och klickar på Testa. En topp ska nu vara i mitten av varje hål. Justera diametervärdena om det behövs.
- I inställningarna för Tröskelvärde justerar du A-värdet tills den binariserade testbilden endast visar vita områden där hålen finns.
- I inställningarna för blobar klickar du på Testa. En klump per segmenterat hål bör visas. Öka kantlinjen för att ta bort blobbarna från bildens kanter, om du vill.
- I gitterinställningarna klickar du på Testa. Justera parametrar tills alla blobbar har förvandlats till gitterpunkter. Klicka på OK.
- Klicka på linjalverktyget och mät avståndet mellan två gitterpunkter. I gitterinställningarna ändrar du Avstånd till det avståndet.
- Håll muspekaren över varje gitterpunkt för att se medelintensitet, medeltjocklek, standardavvikelseintensitet och standardavvikelsetjocklek. Anteckna intensiteterna för varje gitterpunkt och använd dem för att ställa in önskade parametrar för istjocklek i exponeringsinställningarna.
- Mät avståndet och vinkeln från en gitterpunkt till mitten av 4 hål med linjalverktyget. I exponeringsinställningarna tar du bort de aktuella fokusmålen. Klicka på Autofyll och ändra radien och vinkeln till de uppmätta värdena. Klicka på Testmål, klicka på OK och klicka på Skicka mål.
OBS: Leginon kommer att hitta eucentriskt fokus (fokusnod) och samla in exponeringar, som kommer att visas i noden Exponering. - När alla mål har avbildats går du till noden Exposure_Targeting för att se nästa hålbild. Avmarkera Tillåt användarverifiering av valda mål i inställningarna. Avmarkera också Köa upp mål och Hoppa över automatisk hålsökare. Klicka på OK och klicka på Skicka mål.
OBS: Leginon kommer automatiskt att samla in bilder baserat på de inställningar som konfigurerats ovan. Se bilder och metadata i Appion.
- Ändringar kan göras under automatisk insamling. Du kan till exempel när som helst ändra samlingens oskärpeintervall genom att redigera enn-förinställningen i Preset_Manager.
- Om insamlingen behöver stoppas avslutar du kön genom att klicka på knapparna Avbryt och Avbryt kö i noderna Hål och Exponering.
- När samlingen är klar går du till Application och klickar på Kill, går sedan till File och klickar på Exit.
2. Smart Leginon Autoscreen-användning
- Skapa en Smart Leginon Template-session
- Följ instruktionerna i avsnitt 1 för att starta Leginon.
- Gå till Program och klicka på Kör. I fönstret Kör program väljer du Ptolemaios-programmet (välj Visa alla om det behövs). Ställ in main på Leginon-datorn och scope och kamera på respektive dator.
- I Preset_Manager importerar du förinställningar enligt beskrivningen i steg 1.2.3.
- Konfigurera nodinställningar.
- I inställningarna för Square_Targeting noder kontrollerar du att Sortera mål efter kortaste sökväg och Aktivera automatisk inriktning är markerade (kompletterande bild 1A).
- I inställningarna för fyrkantig nod kontrollerar du att Vänta tills noden bearbetar avbildningen är markerad. Lägg till förinställningen Fyrkant i listan till höger från rullgardinsmenyn om den inte redan finns där. I Avancerade inställningar, kontrollera ställ in dessa bländare medan du avbildar och se till att värdena för de två bländarna är korrekta (kompletterande figur 1B).
- I inställningarna för Hole_Targeting nod markerar du Tillåt användarverifiering av valda mål. Avmarkera Köa upp mål och Hoppa över automatisk hålsökare (kompletterande figur 2A).
- I inställningen Hålnod markerar du Vänta tills en nod har bearbetat bilden och Hålförinställningen finns i listan till höger. I Avancerade inställningar, kontrollera ställ in dessa bländare medan du tar bilder och se till att värdena för de två bländarna är korrekta (kompletterande figur 2B).
- I inställningarna för Exposure_Targeting nod markerar du Tillåt användarverifiering av valda mål. Avmarkera Köa upp mål och Hoppa över automatisk hålsökare (tilläggsfigur 3A).
- I inställningarna för noden Exponering ser du till att Vänta på att en nod ska bearbeta bilden är avmarkerad, att förinställningen Exponering är listad till höger och i Avancerade inställningar, markera ställ in dessa bländare medan du tar bilder och se till att värdena för de två bländarna är korrekta (Kompletterande figur 3B).
- I inställningarna för fokusnoden, se till att Vänta på att en nod ska bearbeta bilden är avmarkerad, förinställningen för autofokus är listad till höger och önskad autofokusnoggrannhet är inställd på 4 x 10-6 m (kompletterande figur 4A).
- I fokusnodens fokussekvens (bredvid inställningsknappen) aktiverar du endast två autofokussteg för strållutning (kompletterande figur 4B,C).
- I inställningarna för Z_Focus nod ser du till att Vänta på att en nod ska bearbeta bilden är avmarkerad, att hålförinställningen är listad till höger och att önskad autofokusnoggrannhet är 5 x 10-5 m (tilläggsfigur 5A).
- I fokussekvensen för Z_Focus nod, aktivera endast två lågförstoringssteg Stage Lutningssteg (kompletterande figur 5B,C).
- Bestäm gallrets z-höjd enligt beskrivningen i steg 1.2.4.
- Samla in en atlas enligt beskrivningen i steg 1.2.10.
- Ställ in kvadratsökningsparametrar.
- När atlasen har samlats in kommer Ptolemaios att hitta rutor i den Square_Targeting noden. Varje ruta visar en blå cirkel, en så kallad blobb. När du håller muspekaren över varje blobb kommer Leginon att rapportera deras storlek enligt Ptolemaios beräkningar. Anteckna de största och minsta blobarna.
- I inställningarna för Tröskelvärde ändrar du det lägsta och högsta filterintervallet så att det inkluderar önskvärda rutor och utesluter oönskade rutor.
- Klicka på knappen Hitta rutor i det övre verktygsfältet. Justera filterintervallet tills Hitta rutor har bra mål.
- I inställningarna för exponeringen väljer du värden för Maximalt antal mål och Antal målgrupper som ska samplas. Dessa parametrar definierar hur många rutor och grupper av rutor som är mål.
- När du är nöjd med parametrarna klickar du på Play-knappen . Ett exempel på en atlas efter installationen visas i kompletterande figur 6.
- Ställ in parametrar för hålsökning.
- I noden Hole_Targeting använder du linjalverktyget för att mäta diametern på ett hål.
- I mallinställningarna anger du diametern i Slutlig malldiameter och klickar på Testa. Justera diametern tills alla hål har ljusa vita toppar i mitten.
- I inställningarna för Tröskelvärde klickar du på Testa. Justera A-värdet tills den binäriserade bilden endast visar vita områden där det finns hål.
- I inställningarna för blobar väljer du att exkludera kantmål med hjälp av linjalen för att fastställa ett minsta avstånd från kanten och mata in det värdet. Blobbar kan filtreras efter storlek, rundhet och önskat antal. Hovra över blobar för att visa deras värden. Klicka på Testa för att granska aktuella värden.
- I gitterinställningarna, mata in hålens radie och avstånd mellan hålen (använd mätverktyget) och klicka sedan på 42-knappen för att mäta referensintensitetsvärdet för ett vakuumområde (tomt hål eller trasig stödfilm).
- I förvärvsinställningarna markerar du Använd delmängd av förvärvsmålen och ställer in värdet Sample Maximum till ett litet tal, till exempel 2. Ställ in ett brett spektrum av istjocklek, medelvärden och standardavvikelser (mät dessa värden genom att hålla muspekaren över målen). Klicka på Testa inriktning för att slumpa målvalet utifrån värdena ovan.
- Klicka på Play-knappen när du är nöjd med alla inställningar. Leginon kommer att utföra steg Z_Focus och samla in det första målet. En exempelbild efter installationen visas i kompletterande figur 7.
- Ställ in parametrar för exponeringsinriktning.
- I hålinställningarna ställer du in skalskriptet till den hl_finding.sh skriptsökvägen i Ptolemaiosinstallationen. Ange att den lägsta poängen som ska accepteras är ≤0. Mata in hålens radie (använd mätverktyget) och klicka sedan på 42-knappen för att mäta referensintensitetsvärdet för ett vakuumområde (tomt hål eller trasig stödfilm). Klicka på Testa för att hitta hålens gitter.
- I insamlingsinställningarna markerar du Använd delmängd av insamlingsmålen och ställer in värdet Sample Maximum till ett litet tal, till exempel 4, för att samla in på en delmängd av hålen för screening. Ställ in ett brett spektrum av istjocklek, medelvärden och standardavvikelser (mät dessa värden genom att hålla muspekaren över målen).
- Klicka på Play-knappen när du är nöjd med alla inställningar. Leginon kommer att utföra eucentrisk fokusering och samla in bilder med hög förstoring, som kan ses i noden Exponering . En exempelbild efter installationen visas i kompletterande figur 8.
- Kontrollera nästa Exposure_Targeting bild för att se om inställningarna ovan fortfarande är tillräckliga. När du är nöjd avmarkerar du Tillåt användarverifiering av valda mål i inställningarna Exponeringsinriktning och Hålinriktning.
OBS: Avskärmningen bör nu köras obevakad för det aktuella nätet. Den här sessionen kommer att användas som mallsession för alla rutnät.
- När rutnätet är klart klickar du på Arkiv > Avsluta för att stänga Leginon.
- Ställ in Smart Leginon Autoscreen
- I ett terminalfönster kör du Smart Leginons autoscreen.py.
- Välj grafiskt gränssnitt, mata in en kommaseparerad lista över rutnätsplatser som ska visas, mata in full för arbetsflödet, mata in mallsessionens namn att basera nya sessioner på (detta finns i Appion bildvisare) och mata in mallsessionens z-höjdvärde (kompletterande figur 9).
- Ett grafiskt användargränssnitt öppnas så att man kan mata in sessionsnamnet för varje rutnät och välja sina respektive projektassociationer (tilläggsfigur 10).
OBS: Smart Leginon Autoscreen kommer nu att använda mallsessionsinställningarna för att automatiskt screena varje rutnät och växla mellan rutnät obevakat. - Följ med under insamlingen i Leginon, Appion och mikroskopdatorn, eller lämna mikroskopet helt utan uppsikt.
OBS: När alla galler är screenade kommer Smart Leginon att stänga kolonnventilerna på mikroskopet.
Representative Results
Enligt protokollet kan cryoEM-screeningsessioner köras automatiskt och framgångsrikt för majoriteten (80%-90%) av håliga galler och förhållanden. Flera exempel och experiment har presenterats tidigare 8,9 för att visa de förväntade resultaten av framgångsrika Smart Leginon Autoscreen-sessioner. En lyckad Autoscreen-session börjar med ~10 minuters installation och resulterar vanligtvis i en hel kassett med 12 rutnät som screenas automatiskt efter cirka 6 timmar (30 min per rutnät) där 3-5 rutor av olika storlekar och 3-5 hål per ruta avbildas med hög förstoring, vilket gör att användaren snabbt kan bestämma provets egenskaper på varje rutnät och snabbt iterera genom prov-/rutnätsförhållanden (Figur 3). Ibland misslyckas sessioner, vanligtvis på grund av att Autoscreen riktar in sig på trasiga rutor, inte tolkar stora istjockleksgradienter över rutnätet eller över rutor korrekt, eller misslyckas med att identifiera hål korrekt på kolrutnät. Dessutom kan potentiella minnesläckor få Leginon att krascha på grund av överdriven minnesanvändning, vilket kan lösas genom att frigöra RAM-minne, eller starta om datorn, eller förbättras genom att lägga till mer RAM-minne till datorn.
Bild 1: Smart Leginon Autoscreen-arbetsflöde. En översikt på hög nivå över Smart Leginon Autoscreen-arbetsflödet. Först skapas en mallsession genom att välja parametrar för ett representativt rutnät i den batch med rutnät som ska granskas. Att ställa in Leginon och skapa en mallsession tar mindre än 45 minuter. För det andra är Autoscreen inställt på att använda mallsessionsparametrarna för att screena alla rutnät i kassetten. Att ställa in Autoscreen tar mindre än 10 minuter. Slutligen avslutar Autoscreen screeningsessionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Konventionell kryoEM-pipeline med en partikel före automatiserad screening. De vanligaste stegen i den konventionella kryoEM-pipelinen för enskilda partiklar före automatiserad siktning, tillsammans med komponenter som kan förbättras. Varje steg är färgat för att approximera hur stor flaskhals steget är i förhållande till andra. Den blå cirkulära pilen representerar flera återkopplingsslingor mellan de flesta stegen. Genomströmningen i flera steg beror i hög grad på urvalet, finansieringen och forskarens plats. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Representativa Smart Leginon Autoscreen-resultat. Representativa flerskaliga bilder enligt Smart Leginon Autoscreen-protokollet samlade på en TFS Krios cryoTEM med ett BioQuantum-energifilter och K3-kamera. (A) En sammansatt "atlas"-bild som visar en översikt över ett kryoEM-rutnät. (B-F) Flerskaliga bilder från angivna platser i rutnätsatlasen. Lågförstoringsbilder i den första raden, medelförstoringsbilder i den andra raden och högförstoringsbilder i den tredje raden valdes automatiskt för att få information om provet från tunna till tjocka isrutor. Istjockleken som uppskattats av Leginon visas på botten. Skalstaplarna är 500 μm i (A) och 10 μm för den första raden, 5 μm för den andra raden och 100 nm för den tredje raden för (B-F). Denna figur har modifierats med tillstånd från Cheng et al.8. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| gr: Rutnät | kvadrat: Fyrkant | hln: Hål | fläkt: Autofokus | fcn: Centralt fokus | enn: Exponering | |
| Förstoring | 210 | 2600 | 6700 | 120000 | 120000 | 120000 |
| Defocus | -0.0002 | -0.00015 | -0.00015 | -2 x 10-06 | -7 x 10-07 | -2,5 x 10-06 |
| Punktstorlek | 5 | 5 | 4 | 2 | 2 | 2 |
| Intensitet | 1.1 | 0.83 | 0.65 | 0.44 | 0.44 | 0.45 |
| Dimension | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 4096 x 4096 |
| Uppväga | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 512, 512 | 0, 0 |
| Binning | 4 × 4 | 4 × 4 | 4 × 4 | 4 × 4 | 2 × 2 | 1 x 1 |
| Exponeringstid (ms) | 200 | 500 | 500 | 500 | 500 | 1000 |
| Före exponering (s) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Dos (e/Å2) | -- | -- | -- | 36.5 | 36.5 | 64.7 |
| Spara Raw-bildrutor | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | Ja |
Tabell 1: Förinställda parametrar för screening av kryoEM-rutnät vid Simons Electron Microscopy Center (SEMC) med hjälp av en Glacios cryoTEM med en Falcon 3EC-kamera. Parametrar för varje förinställning som vanligtvis används på en Glacios cryoTEM med en Falcon 3EC-kamera på SEMC visas. Olika mikroskop kommer att ha olika förstoringar tillgängliga och olika experiment kommer att använda olika parametrar som oskärpa och exponeringstid.
| gr: Rutnät | kvadrat: Fyrkant | hln: Hål | fläkt: Autofokus | fcn: Centralt fokus | enn: Exponering | |
| Förstoring | 64 | 1700 | 2850 | 75000 | 75000 | 75000 |
| Defocus | 0 | -5 x 10-05 | -5 x 10-05 | -1 x 10-06 | -7 x 10-07 | -2 x 10-06 |
| Punktstorlek | 6 | 9 | 9 | 6 | 6 | 7 |
| Intensitet | 0.001 | 1,65 x 10-05 | 1,5 x 10-05 | 4,3 x 10-07 | 4,3 x 10-07 | 5,5 x 10-07 |
| Energifiltrets bredd | -- | -- | -- | 20 | 20 | 20 |
| Dimension | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 1024 x 1024 | 2048 x 2048 | 4096 x 4096 |
| Uppväga | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 |
| Binning | 4 × 4 | 4 × 4 | 4 × 4 | 4 × 4 | 2 × 2 | 1 x 1 |
| Exponeringstid (ms) | 500 | 2000 | 1000 | 500 | 300 | 8700 |
| Före exponering (s) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Dos (e/Å2) | -- | -- | -- | -- | -- | 47.4 |
| Spara Raw-bildrutor | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | Ja |
Tabell 2: Förinställda parametrar för kryoEM-gallerscreening vid SEMC med hjälp av en Krios cryoTEM med en Selectris X- och Falcon 4i-kamera. Parametrar för varje förinställning som vanligtvis används på en Krios med ett Selectris X-energifilter och Falcon 4i-kamera på SEMC visas. Olika mikroskop kommer att ha olika förstoringar tillgängliga och olika experiment kommer att använda olika parametrar som oskärpa och exponeringstid.
| gr: Rutnät | kvadrat: Fyrkant | hln: Hål | fläkt: Autofokus | fcn: Centralt fokus | enn: Exponering | |
| Förstoring | 1550 | 940 | 2250 | 81000 | 81000 | 81000 |
| Defocus | 0 | -5 x 10-05 | -5 x 10-05 | -1 x 10-06 | -7 x 10-07 | -2 x 10-06 |
| Punktstorlek | 4 | 8 | 7 | 6 | 6 | 6 |
| Intensitet | 0.0015 | 0.00017 | 7,3 x 10-05 | 1,3 x 10-06 | 1,3 x 10-06 | 9,2 x 10-07 |
| Energifiltrets bredd | -- | -- | 50 | 20 | 20 | 20 |
| Dimension | 1024 x 1024 | 1440 x 1024 | 1440 x 1024 | 1440 x 1024 | 1008 x 1008 | 5760 x 4092 |
| Uppväga | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 0, 0 | 936, 519 | 0, 0 |
| Binning | 4 × 4 | 8 × 8 | 8 × 8 | 8 × 8 | 4 × 4 | 2 × 2 |
| Exponeringstid (ms) | 250 | 600 | 600 | 500 | 500 | 2100 |
| Före exponering (s) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Dos (e/Å2) | -- | -- | -- | -- | -- | 51 |
| Spara Raw-bildrutor | Nej | Nej | Nej | Nej | Nej | Ja |
Tabell 3: Förinställda parametrar för kryoEM-gallerscreening vid SEMC med hjälp av en Krios cryoTEM med en BioQuantum- och K3-kamera. Parametrar för varje förinställning som vanligtvis används på en Krios med ett BioQuantum energifilter och K3-kamera på SEMC visas. Olika mikroskop kommer att ha olika förstoringar tillgängliga och olika experiment kommer att använda olika parametrar som oskärpa och exponeringstid.
Kompletterande figur 1: Inställningar för kvadratisk inriktning och Fyrkantsinställningar för Smart Leginon. (A) Inställningar för kvadratisk inriktning. (B) Fyrkantiga inställningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Inställningar för hålinriktning och hålinställningar för Smart Leginon. (A) Inställningar för hålinriktning. (B) Hålinställningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Inställningar för exponeringsinriktning och exponeringsinställningar för Smart Leginon. (A) Inställningar för exponeringsinriktning. (B) Exponeringsinställningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: Fokusinställningar och fokussekvensinställningar för Smart Leginon. (A) Fokusinställningar. (B) Inställningar för fokussekvens (Defocus1). (C) Inställningar för fokussekvens (Defocus2). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 5: Z_Focus inställningar och Z_Focus Sequence-inställningar för Smart Leginon. (A) Z_Focus inställningar. (B) Z_Focus Sekvensinställningar (Stage_Tilt_Rough). (C) Z_Focus Sekvensinställningar (Stage_Tilt_Fine). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 6: Ett exempel på atlas efter att du har ställt in Smart Leginon Square_Targeting parametrar. Blå cirklar är blobbar, gröna plustecken är förvärvsplatser och det bruna "x" är den aktuella scenplatsen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfigur 7: Ett exempel på atlas efter att du har ställt in Smart Leginon Hole_Targeting parametrar. Lila plustecken är gitterplatser, gröna plustecken med rutor är förvärvsplatser och det blå plustecknet är fokusplatsen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 8: Ett exempel på en atlas efter att du har ställt in Smart Leginon Exposure_Targeting parametrar. Blå cirklar är blobbar, gröna plustecken är förvärvsplatser och det blå plustecknet är fokusplatsen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 9: Smart Leginon Autoscreen-terminalinställning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 10: Smart Leginon Autoscreen gui-inställning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
I det här protokollet beskriver vi pipelinen för Smart Leginon Autoscreen, och dessutom grundläggande Leginon-användning för de som är nya i insamlingsprogramvaran. KryoEM med en partikel är redo att bli den mest produktiva tredimensionella (3D) proteinstrukturupplösningstekniken i slutet av 202417. Pipelinen för kryoEM består av flera steg som ständigt optimeras för att öka datakvaliteten och genomströmningen. Figur 2 visar de vanligaste stegen (provberedning, gallerberedning, screeningtid och ansträngning, högupplöst insamlingstid, livebearbetning och fullständig efterbearbetning) tillsammans med andra komponenter i pipelinen som kan förbättras (screeningmikroskopåtkomst, steghastighet och noggrannhet, kamerahastighet och högupplöst mikroskopåtkomst). Resultat från de flesta steg blir återkopplingsloopar till tidigare steg (blå pilar i bild 2), vilket gör hela pipelinen mycket beroende av varandra. Varje steg i figur 2 är färglagt för att approximera hur stor flaskhals steget är i förhållande till andra. Smart Leginon Autoscreen minskar avsevärt operatörens tid och ansträngning för screening av 12 galler från 6 timmar till mindre än 10 minuter, vilket avlastar flaskhalsen och möjliggör snabbare återkoppling till prov-/gallerberedning (figur 3).
Det finns flera kritiska steg i protokollet, som visas i figur 1. Det är viktigt att rutnätet som används för att skapa mallsessionen är representativt för de återstående rutnäten som ska granskas. Det är viktigt att Leginon kommer ihåg alla inställningar i hela installationsprocessen för att skapa en mallsession (blå steg i figur 1), vilket gör att återkommande mallsessioner kan ställas in snabbare varje gång. När du skapar en mallsession är det viktigaste steget att ställa in inriktning på alla förstoringar så att parametrarna och tröskelvärdena återspeglar den förväntade variationen i de rutnät som ska granskas. De olika "Test"-knapparna möjliggör effektivitet i denna installationsprocess. Under en Autoscreen-session är det viktigt att övervaka de första rutnäten i Appion för att snabbt upptäcka eventuella problem och åtgärda dem i Leginon så snart som möjligt.
Det typiska arbetsflödet på SEMC är att mata in Autoscreen-data i CryoSPARC Live18 och använda denna ytterligare information för att informera återkopplingsslingorna till prov-/rutnätsberedning. Under intensiva kryoEM-optimeringsdagar för forskare och operatörer matas information om prov- och nätförhållandena tillbaka till prov- och rutnätsberedning medan Autoscreen fortfarande screenar galler. Detta gör det möjligt att frysa och screena flera dussin galler per vecka8.
Smart Leginon Autoscreen fungerar för majoriteten (80%-90%) av håliga galler och förhållanden som observeras på SEMC. De återstående 10%-20% av gallren inkluderar de som ibland inte fungerar bra - galler med minimal kontrastskillnad mellan hål och substrat; rutnät med mindre hål och avstånd (t.ex. 0,6/0,8) - och rutnät där det ofta är opraktiskt att rikta in sig på flera rutnät - Spotiton/Chameleon 19,20 rutnät som består av provremsor över rutnätet; snörningsnät. Observera att samlingen med lutande rutnät med Autoscreen är under utveckling men ännu inte är tillgänglig. Det kan vara möjligt att modifiera protokollet så att det fungerar med Spotiton/Chameleon-rutnät genom att först avbilda områden på randen manuellt för att bestämma smala parametertrösklar, sedan försöka gruppera större respektive mindre rutor tillsammans i steg 2.1.7.4 och sedan välja mål från gruppen med is. Målet med denna modifiering är att Smart Leginon ska dela upp tomma och icke-tomma rutor i två grupper. Om parametrar hittas kan det hända att de inte sträcker sig så bra till de återstående rutnäten som ska kontrolleras. Det kan också vara möjligt att modifiera protokollet så att det fungerar med spetsiga rutnät genom att ta bort hl_finding.sh skriptet i steg 2.1.9.1 och konfigurera parametrarna så att de riktar in sig på ljusare/mörkare områden efter önskemål. Framgångsfrekvensen för denna modifiering kan variera från rutnät till rutnät baserat på istjocklek och gallermaterial.
Felsökning under en Autoscreen-session är möjlig och ibland lämplig. Ändringar av förinställda (t.ex. oskärpa) och inriktningsparametrar (t.ex. trösklar för hålinriktning) kan göras under automatisk insamling. När en Autoscreen-session samlas in kan en rutnätssession inte avbrytas eftersom den kommer att avslutas autoscreen.py. Avbryt-knapparna i målnoderna kan dock användas för att hoppa över någon del av ett rutnät eller ett helt rutnät. Ibland kan autoscreen.py använda för mycket minne och frysa, vilket ger två alternativ: "tvångsavsluta" eller "vänta". Om "tvångsavsluta" väljs avslutas hela skriptet, vilket kräver att användaren kör skriptet igen för att tillämpas på de återstående rutnäten för gallring. Om "vänta" är valt kommer skriptet att fortsätta och inställningarna kan ändras för att förhindra framtida frysning, t.ex. att stänga av bildvisningen i noden Exponering, minska pixelstorleken i atlasen eller köra ett skript för minnesrensning. Om programmet fryser utan att erbjuda de två alternativen kan det hända att minnesfelen inte löser sig av sig själva, vilket orsakar en paus i förvärvet. Alternativet "tvångsavsluta" kan vara användbart i det här fallet.
Smart Leginon Autoscreen används regelbundet på SEMC. I takt med att flaskhalsarna i kryoEM-pipelinen för enskilda partiklar fortsätter att minska, kommer användningen av kryoEM att fortsätta att öka för att hjälpa till att besvara biologiska frågor. Detta protokoll är ett steg i riktning mot att optimera hela pipelinen genom att tillhandahålla en tydlig väg för att avsevärt minska återkopplingsslingor.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
En del av detta arbete utfördes vid Simons Electron Microscopy Center vid New York Structural Biology Center, med stöd från Simons Foundation (SF349247), NIH (U24 GM129539) och NY State Assembly.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glacios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | GLACIOSTEM | FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera |
| Krios cryoTEM | Thermo Fisher Scientific | KRIOSG4TEM | XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera |
| Leginon | Simons Electron Microscopy Center | http://leginon.org | |
| Ptolemy | Simons Machine Learning Center | https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy |
References
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. Cryo-EM grid optimization for membrane proteins. iScience. 24 (3), 102139 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Koh, A., et al. Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope. Journal of Visualized Experiments. 181, 63519 (2022).
- Cheng, A., et al. Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon. IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).
- Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy. IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).
- Bepler, T., et al. Smart data collection for CryoEM. Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913 (2022).
- Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope. eLife. 11, e80047 (2022).
- Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. Smart EPU: SPA Getting Intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).
- Fan, Q., et al. CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection. arXiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging. bioRxiv. Biophysics. , (2022).
- Lander, G. C., et al. Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
- Russo, C. J. The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , https://chanzuckerberg.com/science/meetings/hardware-frontiers-cryoet-workshop/ (2023).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. 168, 62271 (2021).
- Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).
