Summary
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en dyremodel af multipel sklerose (MS), som deler med den menneskelige sygdom et robust humoralt autoimmun respons. Her rapporterer vi en enkel og fleksibel ELISA-protokol til kvantificering af autoantistoffer i serum fra EAE-immuniserede mus.
Abstract
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en sygdomsmodel, der rekapitulerer den autoimmune lidelse multipel sklerose (MS) på histopatologisk og molekylært niveau. EAE induceres ved immunisering af forsøgsdyr via subkutan injektion af korte myelinpeptider sammen med specifikke adjuvanser for at øge immunresponset. Ligesom den menneskelige modstykke udvikler EAE-mus demyeliniserende læsioner, immuncelleinfiltration i centralnervesystemet (CNS), gliaaktivering og neuronal skade. En konsistent mængde beviser understøtter også en mekanistisk rolle for B-celledysfunktion i ætiologien af både MS og EAE. B-celler kan tjene som antigenpræsenterende celler såvel som en primær kilde til proinflammatoriske cytokiner og autoantistoffer. I EAE genereres antistoffer mod myelinpeptiderne, der blev anvendt til at fremkalde sygdommen. Sådanne autoantistoffer har vist sig at mediere enten myelintab eller patogen T-celle reaktivering i CNS. Denne artikel beskriver en effektiv ELISA-baseret protokol til kvantificering af autoantistoffer i serum fra C57BL/6J-mus, der er immuniseret med myelinoligodendrocytglycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptidet. Den foreslåede metode tjener som et kraftfuldt værktøj til at undersøge specificiteten og størrelsen af det afvigende humorale respons i forbindelse med autoimmun demyelinisering.
Introduction
Multipel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun sygdom i centralnervesystemet (CNS) karakteriseret ved fokal infiltration af immunceller i hjernens parenchyma, nedbrydning af myelinskeder, indpakning af axoner, gliaaktivering og neuronalt tab1. Ud over den veletablerede rolle patogene T-celler har flere bevislinjer fremhævet involveringen af B-celler i formidling af det autoimmune respons mod CNS. B-celler gennemgår klonal ekspansion i MS-hjernen, og antistoffer mod myelinkomponenter er blevet påvist i demyelinerede læsioner 2,3. Den selektive aktivering af perifere B-celler ved sygdomsdebut er for nylig blevet dokumenteret, hvilket tyder på en formodet rolle for dette immuncellerum også i sygdomsinitiering4. Succesen med B-cellenedbrydende terapier såsom anti-CD20 monoklonale antistoffer bekræfter yderligere den mekanistiske forbindelse mellem afvigende B-cellefunktion og autoimmun demyelinering 5,6. Fra et molekylært synspunkt kan B-celler bidrage til sygdom via autoantigenpræsentation, proinflammatorisk cytokinsekretion og autoreaktiv antistofproduktion.
Flere dyremodeller er blevet udviklet til at rekapitulere specifikke træk ved den komplekse MS-fænotype. Blandt dem er eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) det mest anvendte in vivo-paradigme og er afhængig af immunisering af forsøgsdyr med korte peptider afledt af myelinproteiner, såsom myelinoligodendrocytglycoprotein (MOG) og myelinbasisk protein (MBP)7. EAE-immuniserede dyr udvikler en demyeliniserende patologi, der ligner MS i mange aspekter, herunder et robust humoralt respons mod det encephalitogene peptid8. Af denne grund har EAE-undersøgelser været medvirkende til at dissekere funktionen af B-celler og autoantistoffer i forbindelse med sygdom. For eksempel blev det påvist, at MOG-specifikke antistoffer isoleret fra MS-patienter kan forværre det kliniske forløb i EAE-modeller9. Især blev prolinresten i position 42 i human MOG vist at være kritisk til bestemmelse af autoantistofpatogenicitet10. For nylig har MOG-specifikke autoantistoffer vist sig at fremme sygdom ikke kun ved at formidle myelintab, men også ved at øge reaktiveringen af autoreaktive T-celler i CNS11.
I betragtning af vigtigheden af antistofresponser i CNS-autoimmunitet præsenterer denne artikel en ELISA-baseret protokol til effektivt at måle serumniveauerne af autoreaktive antistoffer i C57BL/6J-mus EAE immuniseret med MOG35-55-peptid. I den første del af protokollen beskrives metoden til opsamling af serum via intrakardial punktering. Derefter vil procedurerne for oprettelse af ELISA-analysen og erhvervelse af dataene blive detaljeret. Endelig vil dataanalyse og fortolkning blive diskuteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverede mus, blev udført i overensstemmelse med eksperimentelle retningslinjer godkendt af East Carolina University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wildtype C57BL/6J hunmus mellem 8-10 uger blev anvendt i denne undersøgelse. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel). EAE blev induceret efter tidligere offentliggjorte rapporter 12,13,14.
1. Indsamling af serum
- Aflive forsøgsmusen ved CO2 -kvælning eller isofluran -overdosis på det krævede tidspunkt (efter institutionelt godkendte protokoller) efter inducering af EAE via MOG35-55 immunisering.
BEMÆRK: Det samlede antal mus og tidspunkter for serumopsamling kan variere afhængigt af det specifikke eksperiment. - Når fraværet af vitale tegn er bekræftet af tå- eller haleklemme, skal du placere musen i en dorsal liggende stilling på en dissektionsbakke og fastgøre lemmerne på plads med stifter eller tape. Orienter musekroppen mod LED-lyskilden (se materialetabel) for at belyse dyrets brystkasse.
- Sprøjt musepelsen med 70% ethanol og lav et midterlinjesnit på 3-4 cm langs maven fra bækkenet til xiphoiden ved hjælp af dissektorsaksen, og pas på at undgå organer og større kar (figur 1A-C). For at lette proceduren skal du bruge tangen til at gribe huden over xiphoid-processen.
- Skær gennem membranen sideværts, og klip derefter brystkassen anteriort på begge sidekanter ved hjælp af fjedersaksen, og stop, før du når brystbenet ved midterlinjen (figur 1D). Fold ribbenklappen, der blev oprettet over musehovedet for at blotte hjertet (figur 1E).
BEMÆRK: Skæring af brystbenet bør undgås, da dette vil beskadige de vigtigste thoraxarterier, der ligger ved siden af knoglen og reducere mængden af blod, der kan opsamles. - Indsæt en 25 G kanyle tilsluttet en 1 ml sprøjte i venstre ventrikel og opsaml blodet ved forsigtigt at trække stemplet tilbage (figur 1F). For at lette nålepunktionen skal du forsigtigt afstive hjertet mod et par tang.
BEMÆRK: Hvis blodet ikke straks kommer ud i sprøjten, skal nålen drejes langsomt, og en anden vinkel skal testes. Der bør dog gøres en indsats for at placere nålen korrekt ved første forsøg for at undgå at skabe unødvendige huller i hjertet, hvor blod kan sive ud. - Overfør blodet til et sterilt 1,5 ml rør og lad det størkne i 30 minutter ved stuetemperatur. Koagulationen fjernes ved centrifugering ved 2000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Supernatanten, som repræsenterer serumfraktionen, oplagres i alikvoter til engangsbrug i kryogene glas ved -80 °C med henblik på fremtidig testning.
2. ELISA-analyse
- Resuspender det frysetørrede MOG35-55 peptid (se tabel over materialer) i vand for at opnå en 10 mg / ml lager. Før forsøget påbegyndes, fortyndes stammen til 10 μg/ml i belægningsbuffer (se materialetabellen) og pipetteres 100 μL/hul af den endelige opløsning til en plade med 96 huller. Pladen forsegles med en klæbende film for at undgå fordampning, og pladen inkuberes natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Der skal beregnes mindst 2 huller for hver prøve, og der skal også medtages yderligere huller til blindprøvekontrol. - Parallelt hermed dækkes det samme antal huller med 100 μL/hul bovint serumalbumin (BSA) opløst i belægningsbuffer ved en koncentration på 10 μg/ml. Disse ekstra brønde fungerer som baggrundskontrol.
BEMÆRK: Det anbefales at belægge kontrolhullerne med BSA, da belægnings- og blokeringsbufferne har forskellige sammensætninger. Bemærk, at andre encefalatogene peptider (såsom PLP139-151 eller MBP84-104) kan anvendes som irrelevante antigener som alternativ til BSA. - Dagen efter vaskes pladen 3 gange med 200 μL/hul fosfatbuffersaltvand suppleret med 0,05% Tween 20 (PBS-T). Derefter tilsættes 100 μL/hul af en blokerende opløsning fremstillet af 3% BSA i PBS (uden Tween 20), og pladen forsegles i 1 time ved 37 °C i en hybridiseringsovn.
- Pladen vaskes 3 gange med 200 μL/hul PBS-T. Hver serumprøve fortyndes 1:100 i blokerende opløsning, og der tilsættes 100 μL/hul til både MOG35-55- og BSA-belagte huller. Der tilsættes det samme volumen blokeringsopløsning til hullerne, der betegnes som emner. Pladen inkuberes forseglet i 2 timer ved stuetemperatur under konstant omrystning (250 o / min).
- Pladen vaskes 3 gange med 200 μL/hul PBS-T. Det HRP-konjugerede sekundære antistof fortyndes (1:2000, se materialetabellen) i en opløsning fremstillet af 0,2 % BSA i PBS-T, og der tilsættes 100 μL/hul til alle huller. Inkuber pladen forseglet i 1 time ved stuetemperatur med konstant omrystning (250 o / min).
- Pladen vaskes 3 gange med 200 μL/hul PBS-T. Der tilsættes 100 μL/hul 3,3',5,5' tetramethylbenzidin (TMB) substrat (se materialetabellen) til alle hullerne og inkuberes i mørke i 1-5 minutter, idet udviklingen af en blå farve overvåges.
- Reaktionen standses ved tilsætning af 100 μL/hul stopopløsning (se materialetabel), og den optiske massefylde (OD) måles i hvert hul ved hjælp af en pladelæser indstillet til en bølgelængde på 450 nm.
BEMÆRK: TMB-substratet skal ekvilibreres ved stuetemperatur i 30-60 minutter, før det tilsættes til brøndene.
- Reaktionen standses ved tilsætning af 100 μL/hul stopopløsning (se materialetabel), og den optiske massefylde (OD) måles i hvert hul ved hjælp af en pladelæser indstillet til en bølgelængde på 450 nm.
3. Analyse af data
- Udfyld et Excel-regneark med OD-værdierne, der læses fra pladen. Gennemsnittet af OD-værdierne fra dobbeltbrønde (både MOG35-55 og BSA-belagt) for hver prøve.
- For hver prøve trækkes middelværdien af de BSA-belagte brønde fra middelværdien af MOG35-55-coatede huller. De resulterende baggrundskorrigerede værdier vil være proportionale med koncentrationen af anti-MOG35-55 antistoffer i de forskellige serumprøver.
BEMÆRK: Tomme felter bør resultere i korrigerede værdier omkring 0. - Anvend en ikke-parametrisk statistisk test såsom Mann-Whitney U-testen for at sammenligne de gennemsnitlige OD-værdier mellem to eksperimentelle betingelser. Medtag mindst 3 uafhængige prøver for hver tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere robustheden af det nuværende ELISA-assay blev metoden testet på serumprøver isoleret fra en kohorte af C57BL/6J hunmus 20 dage efter immunisering (dpi) med 100 μg MOG35-55-peptid i komplet Freunds adjuvans (CFA) efter en valideret EAE-induktionsprotokol 12,13,14. Dyrene modtog også 400 ng kighostetoksin på dag 0 og 2. Serumprøver fra mock immuniserede dyr med alt, men uden peptidet, tjente som negative kontroller. Alle EAE-mus udviklede de første tegn på sygdom mellem 11-14 dpi og nåede med 20 dpi en gennemsnitlig score på 2,6 ± 0,6 (standardfejl, SE) på en skala fra 0-6 (0, ingen tegn; 1, nedsat haletone; 2, mild monoparese eller paraparese; 3, svær paraparese; 4, paraplegi; 5, quadriparese; og 6, døende eller død)12. Som forventet viste EAE-prøverne signifikant højere OD-værdier sammenlignet med kontrolprøver (figur 2). Disse data bekræfter tilstedeværelsen af et robust IgG-immunglobulinrespons mod MOG-peptidet på toppen af sygdommen.
Figur 1: Hjertepunkteringsprocedure. (A-E) Repræsentative billeder af thoracotomiproceduren for at få adgang til hjertet hos voksne mus. (F) Repræsentativt billede af den korrekte procedure for nålestik i venstre ventrikel i musehjertet. Relevante anatomiske strukturer er angivet i hvert panel for at lette dissektionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: MOG-peptid autoantistof ELISA. Serumniveauer af anti-MOG35-55 IgG-immunglobuliner blev testet i EAE og mock immuniserede mus 20 dage efter immunisering (dpi) ved hjælp af den rapporterede ELISA-protokol. Konsekvent højere OD-værdier blev påvist i EAE-prøver sammenlignet med kontroller. Data præsenteres som middel ± SE (N = 3 pr. Gruppe). Forskelle mellem grupper blev vurderet ved en-tailed Mann-Whitney U-test, *P ≤ 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her blev en enkel og effektiv ELISA-baseret protokol rapporteret for nøjagtigt at kvantificere det humorale respons i en relevant dyremodel af MS-patologi. Denne metode er for nylig blevet anvendt til at beskrive den nye rolle af ataxin-1-proteinet i at kontrollere serumniveauerne af autoantistoffer i MOG35-55 / C57BL6J EAE-paradigme12. I den forbindelse bør der tages hensyn til en række faktorer for at opnå konsistente og biologisk meningsfulde resultater med denne metode.
For det første er det afgørende at indsamle serumprøver af høj kvalitet og undgå hæmolyse. Hæmoglobin og andre intracellulære komponenter frigivet fra røde blodlegemer i stærkt hæmolyserede prøver kan forstyrre antigen-antistofreaktionen og relativ farvemåling i ELISA-assayet. For at forhindre hæmolyse foretrækkes det at undgå højt undertryk i sprøjten under blodindsamling, da dette kan få erytrocytter til at briste.
For det andet er det vigtigt at fortynde serumprøverne for at opnå OD-værdier inden for den lineære del af absorbanskurven. Vores anbefalede fortyndingsfaktor (1:100) blev kalibreret på enheden af EAE-patologien induceret i vores musestammer. I betragtning af det iboende niveau af heterogenitet af denne in vivo-model anbefales det stærkt at udføre indledende titreringseksperimenter for at identificere den ideelle fortyndingsfaktor for den specifikke EAE-patologi, der testes. På samme måde kan inkubationstiderne med TMB-substratet justeres for at undgå mætning af det kromogene signal og opretholde OD-værdierne inden for 0-2-området.
For det tredje er de korrigerede OD-værdier opnået i denne protokol kompatible med en semikvantitativ analyse af autoantistofserumtitere mellem forskellige eksperimentelle betingelser eller til kinetiske undersøgelser langs sygdomsprogression. Hvis der er behov for en absolut kvantificering af autoantistofniveauerne, skal ELISA-designet anvendes en kalibreringskurve. Flere antistoffer mod MOG-peptid er kommercielt tilgængelige og kan bruges som pålidelige standarder til beregning af koncentrationen af MOG-specifikke antistoffer i serum fra EAE-mus. For at fange effekter af forskellig størrelse anbefales det at inkludere en lang række fortyndinger for det kalibrerende antistof (fra pg/ml til μg/ml koncentrationer).
Endelig er denne protokol yderst fleksibel og kan let tilpasses til at imødekomme forskellige forskningsbehov. For eksempel kan det coatede encefalatogene peptid varieres for at vurdere autoantistofresponset i andre EAE-paradigmer. Desuden kan forskellige sekundære antistoffer anvendes til at måle niveauerne af forskellige immunglobulinklasser. Til dette formål demonstrerede denne protokol med succes, at ataxin-1 styrer både IgG- og IgM-klasser af MOG-peptidspecifikke antistoffer12. Endelig kunne man forestille sig en mulig anvendelse til påvisning af autoantistoffer i blodet hos MS-patienter. Der er imidlertid betydelige forskelle mellem EAE- og MS-sygdomme. Mens førstnævnte induceres kunstigt ved at øge immunresponset mod et veldefineret autoantigen med stærke adjuvanser, opstår sidstnævnte spontant, og der er endnu ikke identificeret entydige autoantigener. Nylige beviser tyder på mulig involvering af molekylær efterligning med virale proteiner15. Derfor bør forbehold altid tages i betragtning, når observationer indsamlet i denne dyremodel direkte oversættes til den menneskelige sygdom.
Sammenfattende repræsenterer denne protokol et let og bekvemt alternativ til kommercielle ELISA-sæt og kan effektivt kombineres med andre metoder såsom cellebaserede assays (CBA'er) til præcis estimering af autoantistoffrigivelse i forbindelse med autoimmun demyelinisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (R03NS131908) og Department of Defense gennem Multiple Sclerosis Research Program under Award No. W81XWH-22-1-0517. Udtalelser, fortolkninger, konklusioner og anbefalinger er forfatterens og er ikke nødvendigvis godkendt af forsvarsministeriet. Denne undersøgelse blev også støttet af East Carolina University opstartsfonde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A.
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
