Summary
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.
Abstract
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de enfermedad que recapitula el trastorno autoinmune esclerosis múltiple (EM) a nivel histopatológico y molecular. La EAE se induce mediante la inmunización de animales de experimentación mediante inyección subcutánea de péptidos de mielina corta junto con adyuvantes específicos para impulsar la respuesta inmunitaria. Al igual que los humanos, los ratones EAE desarrollan lesiones desmielinizantes, infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC), activación de la glía y lesión neuronal. Un cuerpo consistente de evidencia también apoya un papel mecanicista para la disfunción de las células B en la etiología tanto de la EM como de la EAE. Las células B pueden servir como células presentadoras de antígenos, así como una fuente principal de citocinas proinflamatorias y autoanticuerpos. En la EAE, se generan anticuerpos contra los péptidos de mielina que se emplearon para inducir la enfermedad. Se ha demostrado que estos autoanticuerpos median la pérdida de mielina o la reactivación patogénica de las células T en el SNC. Este artículo describe un protocolo eficiente basado en ELISA para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones C57BL/6J inmunizados con el péptido glicoproteína de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG35-55). El método propuesto sirve como una poderosa herramienta para investigar la especificidad y magnitud de la respuesta humoral aberrante en el contexto de la desmielinización autoinmune.
Introduction
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune crónica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por la infiltración focal de células inmunitarias en el parénquima cerebral, la ruptura de las vainas de mielina que envuelven los axones, la activación de la glía y la pérdida neuronal1. Además del papel bien establecido de las células T patógenas, múltiples líneas de evidencia han destacado la participación de las células B en la mediación de la respuesta autoinmune contra el SNC. Las células B experimentan una expansión clonal en el cerebro de la EM y se han detectado anticuerpos contra los componentes de la mielina dentro de las lesiones desmielinizadas 2,3. Recientemente se ha documentado la activación selectiva de las células B periféricas al inicio de la enfermedad, lo que sugiere un papel putativo de este compartimento de células inmunitarias también en el inicio de la enfermedad4. El éxito de las terapias de agotamiento de linfocitos B, como los anticuerpos monoclonales anti-CD20, corrobora aún más la conexión mecanicista entre el funcionamiento aberrante de los linfocitos B y la desmielinización autoinmune 5,6. Desde un punto de vista molecular, las células B pueden contribuir a la enfermedad a través de la presentación de autoantígenos, la secreción de citocinas proinflamatorias y la producción de anticuerpos autorreactivos.
Se han desarrollado múltiples modelos animales para recapitular las características específicas del complejo fenotipo de la EM. Entre ellos, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el paradigma in vivo más utilizado y se basa en la inmunización de animales de experimentación con péptidos cortos derivados de proteínas de mielina como la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) y la proteína básica de mielina (MBP)7. Los animales inmunizados con EAE desarrollan una patología desmielinizante que se asemeja a la EM en muchos aspectos, incluyendo una respuesta humoral robusta frente al péptido encefalogénico8. Por este motivo, los estudios de EAE han sido fundamentales para diseccionar la función de las células B y los autoanticuerpos en el contexto de la enfermedad. Por ejemplo, se demostró que los anticuerpos específicos de MOG aislados de pacientes con EM pueden agravar el curso clínico en modelos EAE9. En particular, se demostró que el residuo de prolina en la posición 42 en el MOG humano es crítico para determinar la patogenicidad de los autoanticuerpos10. Más recientemente, se ha descubierto que los autoanticuerpos específicos de MOG promueven la enfermedad no solo al mediar la pérdida de mielina, sino también al estimular la reactivación de las células T autorreactivas dentro del SNC11.
Teniendo en cuenta la importancia de las respuestas de anticuerpos en la autoinmunidad del SNC, este artículo presenta un protocolo basado en ELISA para medir de manera eficiente los niveles séricos de anticuerpos autorreactivos en ratones C57BL/6J EAE inmunizados con el péptido MOG35-55. En la primera parte del protocolo se describirá el método de recogida de suero mediante punción intracardíaca. Posteriormente, se detallarán los procedimientos para configurar el ensayo ELISA y adquirir los datos. Por último, se discutirá el análisis e interpretación de los datos.
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Protocol
Todos los procedimientos con ratones se realizaron de acuerdo con las pautas experimentales aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Este (IACUC). En este estudio se utilizaron ratones hembra de tipo salvaje C57BL/6J de entre 8 y 10 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). La EAE fue inducida a partir de los reportes previamente publicados 12,13,14.
1. Colección de sérums
- Eutanasia del ratón experimental mediante asfixia por CO2 o sobredosis de isoflurano en el momento requerido (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) después de inducir EAE mediante inmunización MOG35-55.
NOTA: El número total de ratones y los puntos de tiempo para la recolección de suero pueden variar según el experimento específico. - Después de que se confirme la ausencia de signos vitales mediante un pellizco en la punta del pie o la cola, coloque el ratón en posición de decúbito dorsal en una bandeja de disección y fije las extremidades en su posición con alfileres o cinta adhesiva. Oriente el cuerpo del ratón hacia la fuente de luz LED (ver Tabla de materiales) para iluminar el tórax del animal.
- Rocíe el pelaje del ratón con etanol al 70% y haga una incisión en la línea media de 3-4 cm a lo largo del abdomen desde la pelvis hasta el xifoides con las tijeras de disector, teniendo cuidado de evitar cualquier órgano y vasos principales (Figura 1A-C). Para facilitar el procedimiento, use las pinzas para agarrar la piel sobre la apófisis xifoides.
- Corte el diafragma lateralmente y luego corte la caja torácica anteriormente en ambos bordes laterales con las tijeras de resorte, deteniéndose antes de llegar al esternón en la línea media (Figura 1D). Dobla la solapa de la costilla que se creó sobre la cabeza del ratón para exponer el corazón (Figura 1E).
NOTA: Se debe evitar cortar el esternón, ya que esto dañará las arterias torácicas principales que se encuentran adyacentes al hueso y reducirá el volumen de sangre que se puede recolectar. - Inserte una aguja de 25 G conectada a una jeringa de 1 ml en el ventrículo izquierdo y recoja la sangre tirando suavemente del émbolo hacia atrás (Figura 1F). Para facilitar la punción de la aguja, sujete suavemente el corazón contra un par de fórceps.
NOTA: Si la sangre no aparece inmediatamente en la jeringa, la aguja debe girarse lentamente y se debe probar un ángulo diferente. Sin embargo, se deben hacer esfuerzos para colocar la aguja correctamente en el primer intento para evitar crear orificios innecesarios en el corazón donde la sangre pueda filtrarse. - Transfiera la sangre a un tubo estéril de 1,5 ml y deje que coagule durante 30 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el coágulo por centrifugación a 2000 × g durante 20 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante, que representa la fracción sérica, y almacene las alícuotas de un solo uso en tubos criogénicos a -80 °C para futuras pruebas.
2. Ensayo ELISA
- Vuelva a suspender el péptido MOG35-55 liofilizado (ver Tabla de Materiales) en agua para obtener un stock de 10 mg/mL. Antes de comenzar el experimento, diluya el stock a 10 μg/mL en tampón de recubrimiento (consulte la Tabla de materiales) y pipetee 100 μL/pocillo de la solución final en una placa de 96 pocillos. Selle la placa con una película adhesiva para evitar la evaporación e incube la placa durante la noche a 4 °C.
NOTA: Se deben calcular al menos 2 pocillos para cada muestra y también se deben incluir 2 pocillos adicionales para un control en blanco. - Paralelamente, cubra el mismo número de pocillos con 100 μL/pocillo de albúmina sérica bovina (BSA) disuelta en el tampón de recubrimiento a una concentración de 10 μg/mL. Estos pozos adicionales servirán como controles de fondo.
NOTA: Se recomienda recubrir con BSA los pozos de control ya que los tampones de recubrimiento y bloqueo tienen diferentes composiciones. Tenga en cuenta que otros péptidos encefalogénicos (como PLP139-151 o MBP84-104) podrían usarse como antígenos irrelevantes en alternativa a BSA. - Al día siguiente, lavar la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de solución salina tampón fosfato suplementado con Tween 20 al 0,05% (PBS-T). A continuación, añadir 100 μL/pocillo de una solución de bloqueo compuesta por BSA al 3% en PBS (sin Tween 20) e incubar la placa sellada durante 1 h a 37 °C en un horno de hibridación.
- Lave la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Diluir cada muestra de suero 1:100 en solución de bloqueo y añadir 100 μL/pocillo a los pocillos recubiertos de MOG35-55 y BSA. Agregue el mismo volumen de solución de bloqueo a los pozos designados como espacios en blanco. Incubar la placa sellada durante 2 h a temperatura ambiente, con agitación constante (250 rpm).
- Lave la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Diluir el anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:2000, ver Tabla de Materiales) en una solución hecha de BSA al 0,2% en PBS-T y añadir 100 μL/pocillo a todos los pocillos. Incubar la placa sellada durante 1 h a temperatura ambiente, con agitación constante (250 rpm).
- Lave la placa 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Agregue 100 μL/pocillo de sustrato de tetrametilbencidina (TMB) de 3,3',5,5' (ver Tabla de Materiales) a todos los pocillos e incube en la oscuridad durante 1-5 min, monitoreando el desarrollo de un color azul.
- Detenga la reacción añadiendo 100 μL/pocillo de solución de parada (consulte la Tabla de materiales) y mida la densidad óptica (OD) en cada pocillo utilizando un lector de placas configurado a una longitud de onda de 450 nm.
NOTA: El sustrato de TMB debe equilibrarse a temperatura ambiente durante 30-60 minutos antes de añadirlo a los pocillos.
- Detenga la reacción añadiendo 100 μL/pocillo de solución de parada (consulte la Tabla de materiales) y mida la densidad óptica (OD) en cada pocillo utilizando un lector de placas configurado a una longitud de onda de 450 nm.
3. Análisis de datos
- Rellene una hoja de cálculo de Excel con los valores OD leídos de la placa. Promedie los valores de OD obtenidos de pocillos duplicados (tanto recubiertos con MOG35-55 como con BSA) para cada muestra.
- Para cada muestra, reste el valor medio de los pocillos recubiertos de BSA del de los pocillos recubiertos de MOG35-55. Los valores de fondo corregidos resultantes serán proporcionales a la concentración de anticuerpos anti-MOG35-55 en las diferentes muestras de suero.
NOTA: Los pozos en blanco deben dar como resultado valores corregidos alrededor de 0. - Aplique una prueba estadística no paramétrica, como la prueba U de Mann-Whitney, para comparar los valores promedio de OD entre dos condiciones experimentales. Incluya al menos 3 muestras independientes para cada condición.
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Representative Results
Para demostrar la robustez del presente ensayo ELISA, el método se probó en muestras de suero aisladas de una cohorte de ratones hembra C57BL/6J a los 20 días después de la inmunización (dpi) con 100 μg del péptido MOG35-55 en adyuvante de Freund completo (CFA) siguiendo un protocolo de inducción EAE validado 12,13,14. Los animales también recibieron 400 ng de toxina para la tos ferina los días 0 y 2. Las muestras de suero de animales inmunizados simulados con todo, pero sin el péptido, sirvieron como controles negativos. Todos los ratones EAE desarrollaron los primeros signos de enfermedad entre los 11-14 dpi y alcanzaron a los 20 dpi una puntuación media de 2,6 ± 0,6 (error estándar, EE) en una escala de 0-6 (0, sin signos; 1, tono de cola disminuido; 2, monoparesia o paraparesia leve; 3, paraparesia grave; 4, paraplejia; 5, cuadriparesia; y 6, moribundo o muerte)12. Como era de esperar, las muestras de EAE mostraron valores de OD significativamente más altos en comparación con las muestras control (Figura 2). Estos datos confirman la presencia de una respuesta robusta de inmunoglobulina IgG contra el péptido MOG en el pico de la enfermedad.
Figura 1: Procedimiento de punción cardíaca. (A-E) Imágenes representativas del procedimiento de toracotomía para acceder al corazón en ratones adultos. (F) Imagen representativa del procedimiento correcto para la inserción de la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón del ratón. En cada panel se indican las estructuras anatómicas relevantes para facilitar la disección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ELISA del autoanticuerpo del péptido MOG. Los niveles séricos de inmunoglobulinas IgG anti-MOG35-55 se probaron en EAE y ratones inmunizados simulados a los 20 días después de la inmunización (dpi) utilizando el protocolo ELISA informado. Se detectaron valores de OD consistentemente más altos en las muestras de EAE en comparación con los controles. Los datos se presentan como medias ± SE (N = 3 por grupo). Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante la prueba U de Mann-Whitney de una cola, *P ≤ 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, se informó de un protocolo simple y eficiente basado en ELISA para cuantificar con precisión la respuesta humoral en un modelo animal relevante de patología de EM. Este método se ha empleado recientemente para describir el nuevo papel de la proteína ataxina-1 en el control de los niveles séricos de autoanticuerpos en el paradigma MOG35-55/C57BL6J EAE12. En este sentido, se deben tener en cuenta una serie de factores para obtener resultados consistentes y biológicamente significativos con este método.
En primer lugar, es crucial recoger muestras de suero de alta calidad y evitar la hemólisis. La hemoglobina y otros componentes intracelulares liberados por los glóbulos rojos en muestras muy hemolizadas pueden interferir con la reacción antígeno-anticuerpo y la medición del color relativo en el ensayo ELISA. Para prevenir la hemólisis, es preferible evitar la presión negativa alta en la jeringa durante la extracción de sangre, ya que esto puede provocar la ruptura de los eritrocitos.
En segundo lugar, es importante diluir las muestras de suero para obtener valores de OD dentro de la porción lineal de la curva de absorbancia. Nuestro factor de dilución recomendado (1:100) se calibró sobre la entidad de la patología EAE inducida en nuestras cepas de ratón. Teniendo en cuenta el nivel intrínseco de heterogeneidad de este modelo in vivo , es muy recomendable realizar experimentos preliminares de titulación para identificar el factor de dilución ideal para la patología específica de EAE que se ensaya. Asimismo, se podrán ajustar los tiempos de incubación con el sustrato TMB para evitar la saturación de la señal cromogénica y mantener los valores de OD dentro del rango de 0-2.
En tercer lugar, los valores corregidos de OD obtenidos en este protocolo son compatibles con un análisis semicuantitativo de los títulos séricos de autoanticuerpos entre diferentes condiciones experimentales o para estudios cinéticos a lo largo de la progresión de la enfermedad. Si se necesita una cuantificación absoluta de los niveles de autoanticuerpos, se debe implementar una curva de calibración en el diseño de ELISA. Múltiples anticuerpos contra el péptido MOG están disponibles comercialmente y se pueden utilizar como estándares fiables para calcular la concentración de anticuerpos específicos de MOG en el suero de ratones EAE. Para capturar efectos de diferente magnitud, se recomienda incluir una amplia gama de diluciones para el anticuerpo calibrador (que van desde concentraciones de pg/mL hasta μg/mL).
Por último, este protocolo es extremadamente flexible y puede adaptarse fácilmente a las diferentes necesidades de investigación. Por ejemplo, el péptido encefalogénico recubierto se puede variar para evaluar la respuesta de autoanticuerpos en otros paradigmas de EAE. Además, se pueden emplear diferentes anticuerpos secundarios para medir los niveles de distintas clases de inmunoglobulinas. Con este fin, este protocolo demostró con éxito que la ataxina-1 controla las clases IgG e IgM de anticuerpos específicos del péptido MOG12. Por último, se podría imaginar un posible uso para la detección de autoanticuerpos en la sangre de pacientes con EM. Sin embargo, existen diferencias sustanciales entre las EAE y las enfermedades de EM. Mientras que el primero se induce artificialmente mediante el refuerzo de la respuesta inmunitaria frente a un autoantígeno bien definido con fuertes adyuvantes, el segundo surge espontáneamente y aún no se han identificado autoantígenos inequívocos. Evidencias recientes sugieren la posible implicación del mimetismo molecular con las proteínas virales15. Por lo tanto, siempre se deben tener en cuenta las advertencias al trasladar directamente las observaciones recogidas en este modelo animal a la enfermedad humana.
En resumen, el presente protocolo representa una alternativa fácil y conveniente a los kits comerciales de ELISA y podría combinarse de manera eficiente con otros métodos, como los ensayos basados en células (CBA) para la estimación precisa de la liberación de autoanticuerpos en el contexto de la desmielinización autoinmune.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R03NS131908) y el Departamento de Defensa a través del Programa de Investigación de Esclerosis Múltiple bajo el Premio No. W81XWH-22-1-0517. Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Este estudio también contó con el apoyo de fondos iniciales de la Universidad de Carolina del Este.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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