Summary
L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla (SM), che condivide con la malattia umana una robusta risposta autoimmune umorale. Qui, riportiamo un protocollo ELISA semplice e flessibile per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi immunizzati con EAE.
Abstract
L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello di malattia che ricapitola la malattia autoimmune della sclerosi multipla (SM) a livello istopatologico e molecolare. L'EAE è indotto dall'immunizzazione di animali da esperimento tramite iniezione sottocutanea di peptidi di mielina corta insieme a coadiuvanti specifici per aumentare la risposta immunitaria. Come la controparte umana, i topi EAE sviluppano lesioni demielinizzanti, infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC), attivazione della glia e danno neuronale. Un corpo coerente di prove supporta anche un ruolo meccanicistico per la disfunzione delle cellule B nell'eziologia sia della SM che dell'EAE. Le cellule B possono fungere da cellule presentanti l'antigene e da fonte primaria di citochine pro-infiammatorie e autoanticorpi. Nell'EAE, vengono generati anticorpi contro i peptidi mielinici che sono stati impiegati per indurre la malattia. È stato dimostrato che tali autoanticorpi mediano la perdita di mielina o la riattivazione delle cellule T patogene nel SNC. Questo articolo descrive un efficiente protocollo basato su ELISA per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi C57BL/6J immunizzati con il peptide della glicoproteina 35-55 degli oligodendrociti mielinici (MOG35-55). Il metodo proposto funge da potente strumento per studiare la specificità e l'entità della risposta umorale aberrante nel contesto della demielinizzazione autoimmune.
Introduction
La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da infiltrazione focale di cellule immunitarie nel parenchima cerebrale, rottura delle guaine mieliniche che avvolgono gli assoni, attivazione della glia e perdita neuronale1. Oltre al ruolo ben consolidato delle cellule T patogene, molteplici linee di evidenza hanno evidenziato il coinvolgimento delle cellule B nella mediazione della risposta autoimmune contro il SNC. Le cellule B subiscono un'espansione clonale nel cervello della SM e sono stati rilevati anticorpi contro i componenti della mielina all'interno delle lesioni demieliniche 2,3. L'attivazione selettiva delle cellule B periferiche all'esordio della malattia è stata recentemente documentata, suggerendo un ruolo putativo per questo compartimento immunitario anche nell'inizio della malattia4. Il successo delle terapie che depleiscono le cellule B come gli anticorpi monoclonali anti-CD20 corrobora ulteriormente la connessione meccanicistica tra il funzionamento aberrante delle cellule B e la demielinizzazione autoimmune 5,6. Da un punto di vista molecolare, le cellule B possono contribuire alla malattia attraverso la presentazione di autoantigeni, la secrezione di citochine pro-infiammatorie e la produzione di anticorpi autoreattivi.
Sono stati sviluppati diversi modelli animali per ricapitolare caratteristiche specifiche del fenotipo complesso della SM. Tra questi, l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è il paradigma più utilizzato in vivo e si basa sull'immunizzazione di animali da esperimento con peptidi corti derivati da proteine mieliniche come la glicoproteina oligodendrocitaria mielina (MOG) e la proteina basica della mielina (MBP)7. Gli animali immunizzati con EAE sviluppano una patologia demielinizzante che assomiglia alla SM in molti aspetti, inclusa una robusta risposta umorale contro il peptide encefalitogeno8. Per questo motivo, gli studi EAE sono stati determinanti per sezionare la funzione delle cellule B e degli autoanticorpi nel contesto della malattia. Ad esempio, è stato dimostrato che gli anticorpi specifici per MOG isolati da pazienti con SM possono aggravare il decorso clinico nei modelli EAE9. In particolare, il residuo di prolina in posizione 42 nel MOG umano si è dimostrato fondamentale per determinare la patogenicità degli autoanticorpi10. Più recentemente, è stato scoperto che gli autoanticorpi specifici per MOG promuovono la malattia non solo mediando la perdita di mielina, ma anche aumentando la riattivazione delle cellule T autoreattive all'interno del SNC11.
Considerando l'importanza delle risposte anticorpali nell'autoimmunità del SNC, questo articolo presenta un protocollo basato su ELISA per misurare in modo efficiente i livelli sierici di anticorpi autoreattivi nei topi C57BL/6J EAE immunizzati con peptide MOG35-55. Nella prima parte del protocollo verrà descritto il metodo per raccogliere il siero tramite puntura intracardiaca. Successivamente verranno dettagliate le procedure per impostare il test ELISA e acquisire i dati. Infine, verranno discusse l'analisi e l'interpretazione dei dati.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state eseguite in conformità con le linee guida sperimentali approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della Carolina orientale. In questo studio sono stati utilizzati topi femmina Wildtype C57BL / 6J di età compresa tra 8 e 10 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). L'EAE è stato indotto a seguito di rapporti precedentemente pubblicati 12,13,14.
1. Raccolta del siero
- Eutanasia del topo sperimentale mediante asfissia da CO2 o sovradosaggio di isoflurano al momento richiesto (seguendo protocolli approvati istituzionalmente) dopo aver indotto l'EAE tramite immunizzazione MOG35-55.
NOTA: Il numero totale di topi e i punti temporali per la raccolta del siero possono variare a seconda dell'esperimento specifico. - Dopo che l'assenza di segni vitali è confermata dal pizzicamento del dito del piede o della coda, posizionare il topo in posizione sdraiata dorsale su un vassoio di dissezione e fissare gli arti in posizione con spilli o nastro adesivo. Orientare il corpo del mouse verso la sorgente luminosa a LED (vedere Tabella dei materiali) per illuminare il torace dell'animale.
- Spruzzare il pelo del topo con etanolo al 70% e praticare un'incisione mediana di 3-4 cm lungo l'addome dal bacino allo xifoide utilizzando le forbici di dissezione, facendo attenzione ad evitare eventuali organi e vasi principali (Figura 1A-C). Per facilitare la procedura, usa la pinza per afferrare la pelle durante il processo xifoideo.
- Tagliare lateralmente il diaframma e poi tagliare la gabbia toracica anteriormente su entrambi i bordi laterali usando le forbici a molla, fermandosi prima di raggiungere lo sterno sulla linea mediana (Figura 1D). Piega il lembo costale che è stato creato sopra la testa del topo per esporre il cuore (Figura 1E).
NOTA: Il taglio dello sterno dovrebbe essere evitato in quanto ciò danneggerebbe le principali arterie toraciche adiacenti all'osso e ridurrebbe il volume di sangue che può essere raccolto. - Inserire un ago da 25 G collegato a una siringa da 1 ml nel ventricolo sinistro e raccogliere il sangue tirando delicatamente indietro lo stantuffo (Figura 1F). Per facilitare la puntura dell'ago, appoggiare delicatamente il cuore contro un paio di pinze.
NOTA: Se il sangue non appare immediatamente nella siringa, l'ago deve essere ruotato lentamente e deve essere testato un angolo diverso. Tuttavia, è necessario impegnarsi per posizionare correttamente l'ago al primo tentativo per evitare di creare fori inutili nel cuore in cui il sangue può fuoriuscire. - Trasferire il sangue in una provetta sterile da 1,5 ml e lasciarlo coagulare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il coagulo mediante centrifugazione a 2000 × g per 20 min a 4 °C. Raccogliere il surnatante, che rappresenta la frazione sierica, e conservare le aliquote monouso in provette criogeniche a -80 °C per test futuri.
2. Saggio ELISA
- Risospendere il peptide MOG35-55 liofilizzato (vedi Tabella dei materiali) in acqua per ottenere uno stock di 10 mg/mL. Prima di iniziare l'esperimento, diluire il brodo a 10 μg/mL nel tampone di rivestimento (vedere la tabella dei materiali) e pipettare 100 μL/pozzetto della soluzione finale in una piastra a 96 pozzetti. Sigillare la piastra con una pellicola adesiva per evitare l'evaporazione e incubare la piastra per una notte a 4 °C.
NOTA: Devono essere calcolati almeno 2 pozzetti per ogni campione e devono essere inclusi anche 2 pozzetti aggiuntivi per un controllo in bianco. - Parallelamente, rivestire lo stesso numero di pozzetti con 100 μL/pozzetto di albumina sierica bovina (BSA) disciolta nel tampone di rivestimento a una concentrazione di 10 μg/mL. Questi pozzetti aggiuntivi serviranno come controlli di fondo.
NOTA: Si consiglia di rivestire con BSA i pozzetti di controllo poiché i tamponi di rivestimento e di bloccaggio hanno composizioni diverse. Si prega di notare che altri peptidi encefalitogeni (come PLP139-151 o MBP84-104) potrebbero essere utilizzati come antigeni irrilevanti in alternativa alla BSA. - Il giorno dopo, lavare la piastra 3 volte con 200 μL/pozzetto di soluzione salina tampone fosfato integrata con Tween 20 allo 0,05% (PBS-T). Successivamente, aggiungere 100 μL/pozzetto di una soluzione bloccante a base di BSA al 3% in PBS (senza Tween 20) e incubare la piastra sigillata per 1 ora a 37 °C in un forno di ibridazione.
- Lavare la piastra 3 volte con 200 μL/pozzetto di PBS-T. Diluire ogni campione di siero 1:100 in soluzione bloccante e aggiungere 100 μL/pozzetto a entrambi i pozzetti rivestiti di MOG35-55 e BSA. Aggiungere lo stesso volume di soluzione bloccante ai pozzetti designati come spazi vuoti. Incubare la piastra sigillata per 2 ore a temperatura ambiente, agitando costantemente (250 giri/min).
- Lavare la piastra 3 volte con 200 μL/pozzetto di PBS-T. Diluire l'anticorpo secondario coniugato con HRP (1:2000, vedere Tabella dei materiali) in una soluzione composta da BSA allo 0,2% in PBS-T e aggiungere 100 μL/pozzetto a tutti i pozzetti. Incubare la piastra sigillata per 1 ora a temperatura ambiente, agitando costantemente (250 giri/min).
- Lavare la piastra 3 volte con 200 μL/pozzetto di PBS-T. Aggiungere 100 μL/pozzetto di substrato di tetrametilbenzidina (TMB) da 3,3',5' (vedi Tabella dei materiali) a tutti i pozzetti e incubare al buio per 1-5 minuti, monitorando lo sviluppo di un colore blu.
- Arrestare la reazione aggiungendo 100 μL/pozzetto di soluzione di arresto (vedere la tabella dei materiali) e misurare la densità ottica (OD) in ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato a una lunghezza d'onda di 450 nm.
NOTA: Il substrato TMB deve essere bilanciato a temperatura ambiente per 30-60 minuti prima di aggiungerlo ai pozzetti.
- Arrestare la reazione aggiungendo 100 μL/pozzetto di soluzione di arresto (vedere la tabella dei materiali) e misurare la densità ottica (OD) in ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato a una lunghezza d'onda di 450 nm.
3. Analisi dei dati
- Compilare un foglio di calcolo Excel con i valori OD letti dalla piastra. Fare la media dei valori di OD ottenuti da pozzetti duplicati (sia rivestiti di MOG35-55 che BSA) per ciascun campione.
- Per ogni campione, sottrarre il valore medio dei pozzetti rivestiti di BSA da quello dei pozzetti rivestiti di MOG35-55. I valori corretti di fondo risultanti saranno proporzionali alla concentrazione di anticorpi anti-MOG35-55 nei diversi campioni di siero.
NOTA: I pozzetti vuoti dovrebbero produrre valori corretti intorno a 0. - Applicare un test statistico non parametrico come il test U di Mann-Whitney per confrontare i valori medi di OD tra due condizioni sperimentali. Includere almeno 3 campioni indipendenti per ciascuna condizione.
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Representative Results
Per dimostrare la robustezza del presente test ELISA, il metodo è stato testato su campioni di siero isolati da una coorte di topi femmina C57BL/6J a 20 giorni dopo l'immunizzazione (dpi) con 100 μg di peptide MOG35-55 nell'adiuvante di Freund completo (CFA) seguendo un protocollo di induzione EAE convalidato 12,13,14. Gli animali hanno anche ricevuto 400 ng di tossina della pertosse nei giorni 0 e 2. I campioni di siero di animali finti immunizzati con tutto ma senza il peptide sono serviti come controlli negativi. Tutti i topi EAE hanno sviluppato i primi segni di malattia tra 11-14 dpi e hanno raggiunto di 20 dpi un punteggio medio di 2,6 ± 0,6 (errore standard, SE) su una scala da 0 a 6 (0, nessun segno; 1, diminuzione del tono della coda; 2, lieve monoparesi o paraparesi; 3, paraparesi grave; 4, paraplegia; 5, tetraparesi e 6, moribondo o morte). Come previsto, i campioni EAE hanno mostrato valori di OD significativamente più elevati rispetto ai campioni di controllo (Figura 2). Questi dati confermano la presenza di una robusta risposta immunoglobulina IgG contro il peptide MOG al culmine della malattia.
Figura 1: Procedura di puntura cardiaca. (A-E) Immagini rappresentative della procedura di toracotomia per accedere al cuore nei topi adulti. (F) Immagine rappresentativa della corretta procedura per l'inserimento dell'ago nel ventricolo sinistro del cuore del topo. Le strutture anatomiche rilevanti sono indicate in ogni pannello per facilitare la dissezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: ELISA di autoanticorpi peptidici MOG. I livelli sierici di immunoglobuline IgG anti-MOG35-55 sono stati testati in topi immunizzati EAE e mock immunizzati a 20 giorni dopo l'immunizzazione (dpi) utilizzando il protocollo ELISA riportato. Valori di OD costantemente più elevati sono stati rilevati nei campioni EAE rispetto ai controlli. I dati sono presentati come medie ± SE (N = 3 per gruppo). Le differenze tra i gruppi sono state valutate mediante il test U di Mann-Whitney a una coda, *P ≤ 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, è stato riportato un protocollo basato su ELISA semplice ed efficiente per quantificare accuratamente la risposta umorale in un modello animale rilevante di patologia della SM. Questo metodo è stato recentemente impiegato per descrivere il nuovo ruolo della proteina atassina-1 nel controllo dei livelli sierici di autoanticorpi nel paradigma EAE MOG35-55/C57BL6J12. A questo proposito, è necessario prendere in considerazione una serie di fattori, al fine di ottenere risultati coerenti e biologicamente significativi con questo metodo.
Innanzitutto, è fondamentale raccogliere campioni di siero di alta qualità ed evitare l'emolisi. L'emoglobina e altri componenti intracellulari rilasciati dai globuli rossi in campioni fortemente emolizzati possono interferire con la reazione antigene-anticorpo e la misurazione del colore relativo nel test ELISA. Per prevenire l'emolisi, è preferibile evitare un'elevata pressione negativa nella siringa durante il prelievo del sangue in quanto ciò può causare la rottura degli eritrociti.
In secondo luogo, è importante diluire i campioni di siero per ottenere valori di OD all'interno della porzione lineare della curva di assorbanza. Il nostro fattore di diluizione raccomandato (1:100) è stato calibrato sull'entità della patologia EAE indotta nei nostri ceppi di topo. Considerando il livello intrinseco di eterogeneità di questo modello in vivo , si consiglia vivamente di eseguire esperimenti preliminari di titolazione per identificare il fattore di diluizione ideale per la specifica patologia EAE testata. Allo stesso modo, i tempi di incubazione con il substrato TMB possono essere regolati per evitare la saturazione del segnale cromogenico e mantenere i valori di OD entro l'intervallo 0-2.
In terzo luogo, i valori di OD corretti ottenuti in questo protocollo sono compatibili con un'analisi semiquantitativa dei titoli sierici di autoanticorpi tra diverse condizioni sperimentali o per studi cinetici lungo la progressione della malattia. Se è necessaria una quantificazione assoluta dei livelli di autoanticorpi, è necessario implementare una curva di calibrazione nel progetto ELISA. Sono disponibili in commercio più anticorpi contro il peptide MOG che possono essere utilizzati come standard affidabili per calcolare la concentrazione di anticorpi specifici per MOG nel siero dei topi EAE. Per catturare effetti di diversa entità, si raccomanda di includere un'ampia gamma di diluizioni per l'anticorpo di calibrazione (che vanno da pg/mL a concentrazioni di μg/mL).
Infine, questo protocollo è estremamente flessibile e può essere facilmente adattato per soddisfare le diverse esigenze di ricerca. Ad esempio, il peptide encefalitogeno rivestito può essere variato per valutare la risposta autoanticorpale in altri paradigmi EAE. Inoltre, diversi anticorpi secondari possono essere impiegati per misurare i livelli di classi distinte di immunoglobuline. A tal fine, questo protocollo ha dimostrato con successo che l'atassina-1 controlla entrambe le classi IgG e IgM di anticorpi specifici per il peptide MOG12. Infine, si potrebbe prevedere un possibile uso per rilevare gli autoanticorpi nel sangue dei pazienti con SM. Tuttavia, esistono differenze sostanziali tra le malattie EAE e SM. Mentre il primo è indotto artificialmente attraverso il potenziamento della risposta immunitaria contro un autoantigene ben definito con forti adiuvanti, il secondo si presenta spontaneamente e non sono stati ancora identificati autoantigeni univoci. Recenti evidenze suggeriscono il possibile coinvolgimento del mimetismo molecolare con le proteine virali15. Pertanto, gli avvertimenti dovrebbero sempre essere considerati nel tradurre direttamente le osservazioni raccolte in questo modello animale alla malattia umana.
In sintesi, il presente protocollo rappresenta un'alternativa facile e conveniente ai kit ELISA commerciali e potrebbe essere efficacemente combinato con altri metodi come i saggi basati su cellule (CBA) per la stima precisa del rilascio di autoanticorpi nel contesto della demielinizzazione autoimmune.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (R03NS131908) e dal Dipartimento della Difesa attraverso il programma di ricerca sulla sclerosi multipla con il premio n. W81XWH-22-1-0517. Le opinioni, le interpretazioni, le conclusioni e le raccomandazioni sono quelle dell'autore e non sono necessariamente approvate dal Dipartimento della Difesa. Questo studio è stato supportato anche dai fondi per le startup della East Carolina University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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