Summary
Her beskriver vi en procedure, der muliggør organdækkende påvisning af patogene bakterier under infektion og kvantificering af fluorescerende reporteraktiviteter.
Abstract
De fleste infektioner finder sted i tredimensionelt værtsvæv med indviklet anatomi og lokalt varierende værtsfysiologi. Placeringen af patogenceller i dette forskelligartede miljø påvirker i høj grad deres stressniveauer, responser, skæbne og bidrag til den samlede progression af sygdommen og behandlingssvigt. På grund af de tekniske vanskeligheder med at lokalisere μm-store patogenceller i cm-store værtsorganer har dette forskningsområde imidlertid været relativt uudforsket. Her præsenterer vi en metode til at løse denne udfordring. Vi anvender seriel to-fotontomografi og AI-forbedret billedanalyse til at lokalisere individuelle Salmonella-celler gennem hele milten, leverlapperne og hele lymfeknuderne hos inficerede mus. Ved hjælp af fluorescerende reportere og in vivo antistofadministration kan replikationshastigheden af enkelte Salmonella-celler , deres lokale interaktion med specifikke immunceller og bakterielle reaktioner på antibiotika bestemmes. Disse metoder åbner muligheder for en omfattende undersøgelse af infektioner, deres forebyggelse og behandling inden for den tredimensionelle vævskontekst.
Introduction
Infektioner forekommer i væv med kompleks anatomi og kompartmentopdelt fysiologi. De forskellige mikromiljøer, der sameksisterer i det inficerede væv, kan bestemme skæbnen for lokale patogenundergrupper og deres bidrag til det samlede sygdomsudfald 1,2,3. Omfattende 3D-kortlægning af mikrobielle patogener i væv i cm-størrelse er dog fortsat udfordrende4. Billeddannelse af hjernen og andre organer er et meget aktivt forskningsfelt med konstant forbedrede eksperimentelle strategier5, men mange metoder mangler stadig den sub-μm-opløsning, der ville være nødvendig for at identificere μm-store bakterielle patogener med sikkerhed. I modsætning hertil muliggør seriel to-foton (STP) tomografi6 automatiseret flerfarvet, deformationsfri billeddannelse af hele væv med sub-μm opløsning i planet, hvilket giver fulde volumetriske datasæt. Denne metode kombinerer gentagen fysisk sektionering af vævet ved hjælp af et vibratom med intermitterende to-foton-billeddannelse af de nye blokflader med infrarødt lys. STP-tomografi er blevet brugt i vid udstrækning til kortlægning af tynde axoner i hjernen for at etablere forbindelseskort 7,8,9,10.
STP-tomografi muliggør også 3D-kortlægning af individuelle mikrobielle patogenceller (Salmonella, Toxoplasma) i hele det inficerede væv11,12 ved hjælp af en tomograf. Anden-harmonisk generering afslører kollagenskeder omkring arterier og i fibrøse bånd såsom miltens trabekler, hvilket giver anatomisk kontekst. In vivo injicerede fluorescerende antistoffer kan bruges til at farve værtsceller for at afsløre interaktioner mellem individuelle patogenceller og infiltrerende immunceller såsom neutrofiler. Her beskrives pipelinen, der involverer bearbejdning af vævet, billeddannelse, sammenføjning af billedfliser med belysningskorrektion, stabling af billeder i tre dimensioner og segmentering ved hjælp af maskinlæringsværktøjer. Denne pipeline giver 3D-positioner af individuelle patogener, celler og mikrokolonier inden for deres værtskontekst. Det er fortsat vanskeligt at tælle antallet af individuelle celler i mikrokolonier på grund af opløsningsgrænser, men sådanne tal kan estimeres baseret på mikrokoloniens integrerede lysstyrke. Rørledningen kan let tilpasses til andre infektionsmodeller, hvis rekombinante GFP- eller YFP-udtrykkende patogener er tilgængelige.
Protocol
Alle dyreforsøg, der er beskrevet her, er godkendt af myndighederne (licens 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) og følger lokale retningslinjer (Tierschutz-Verordnung, Basel) og den schweiziske dyrebeskyttelseslov (Tierschutz-Gesetz).
1. Forberedelse og opbevaring af inficeret væv
- Brug en infektionsmodel efter eget valg. Her inficeres 10 til 16 uger gamle mus af begge køn med ~1.000 kolonidannende enheder (CFU) ved intravenøs injektion eller 5 x 107 CFU ved intragastrisk administration med en rundspids nål. Egnede musestammer inkluderer BALB/c og C57BL/6.
BEMÆRK: Den samme tilgang kan nemt tilpasses til andre værtsarter. - Sørg for, at patogener udtrykker fluorescerende proteiner for at muliggøre identifikation i ufarvet væv. Patogener, der udtrykker GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 eller mWasabi16 , kan alle visualiseres ved hjælp af 940 nm excitation17. Salmonella , der udtrykker mCherry18 på niveauer, der let kan påvises ved flowcytometri19 , kunne afbildes ved hjælp af 800 nm excitation, men har dårlige signal-til-baggrundsforhold i inficeret milt og lever, som viser betydelig autofluorescens.
- Sørg for, at alle de fluorescerende proteiner bevarer >70 % af deres fluorescensintensitet efter fiksering med paraformaldehyd ved neutral pH baseret på kvantificering med flowcytometri. Her bruges inficeret musevæv, nemlig milt, lever, lymfeknuder og Peyers plastre.
- Farv værtscelleoverflademarkører in vivo ved at injicere phycoerythrin (PE)-mærkede antistoffer 10 minutter før perfusion. For at farve neutrofiler skal du injicere intravenøst 4 μg anti-Ly-6G-PE i 100 μL PBS. For at farve makrofager i den marginale zone i milten injiceres 4 μg anti-CD169-PE i 100 μL PBS (se materialetabel).
- Fix inficeret væv gennem standard transkardieperfusion20 med 15 ml iskold 50 mM fosfatbuffer (PB; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7,4), efterfulgt af 35 ml 4% paraformaldehyd (PFA; fiksativ) i PB (figur 1A).
- Kort fortalt administreres dyb anæstesi til det inficerede dyr ved intraperitoneal injektion af 100 mg/kg ketamin og 16 mg/kg xylazin. Sørg for korrekt bedøvelse ved at bekræfte tab af tå-klemrefleksen.
- Desinficer pelsen med 70% ethanol, tør den med et sterilt papirhåndklæde, og åbn brystet kirurgisk med en pincet og saks. Placer en steril nål i hjertets venstre ventrikel, åbn højre atrium med en steril saks, og kør den første buffer og derefter fikseringsmiddel gennem nålen, venstre ventrikel og hele det vaskulære system ved hjælp af en pumpe. Dette fikser alt væv hurtigt og ensartet og forårsager eutanasi.
- Opsaml vævet efter perfusion, inkuber det i 20x volumen 4% koldt paraformaldehyd i PB-buffer og læg det på en shaker ved 4 °C natten over (figur 1B). Billeddannelse er mulig for væv i størrelsesområdet 0,05 til 2 cm3. Til større væv skæres i passende stykker.
- Den næste dag vaskes vævet 3 gange i 10 minutter hver med PB-buffer med rystning ved 40 rpm ved stuetemperatur for at fjerne PFA.
BEMÆRK: På grund af PFA-toksicitet skal disse trin udføres inde i et stinkskab. Bortskaffelse af PFA-affaldet i henhold til institutionelle retningslinjer. - Fjern overskydende PB-buffer, og tilsæt 20x volumen kryobeskyttelsesmiddel opbevaringsbuffer21 (876 mM saccharose, 0,25 mM polyvinylpyrrolidon, 40 % (v/v) ethylenglycol, opløst i 50 mM PB-buffer) til prøven med omrystning ved 40 rpm ved 4 °C i 6-8 timer, eller indtil vævene synker til bunds. Inkuber prøver ved -20 °C i mindst 3 dage for at sikre effektiv reduktion af vævsautofluorescens11. Prøver kan bruges i op til 5 år, når de opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK VENLIGST: Synkningen af vævet indikerer korrekt indtrængning af opbevaringsbufferen i vævet.
2. Eksempel på indlejring
- Læg vævet ind i en agaroseblok for glat skæring med et vibratom. Præaktiver agarosen kemisk ved oxidation med periodat og reducer derefter med borhydrid for at danne tværbinding med vævet for forbedret stabilitet under skæreprocessen. Udfør de trin, der er beskrevet nedenfor.
- Forbered 4% oxideret agarose ved at veje 2,25 g agarose og tilsæt 0,21 g NaIO4. Tilsæt 100 ml PB til agarose og NaIO4. Rør ved stuetemperatur i et stinkskab i 2-3 timer med beskyttelse mod lys.
BEMÆRK VENLIGST: Kritisk trin: Overskrid ikke omrøring i mere end 3 timer, ellers vil agarosen polymerisere dårligt. - Agarosen genvindes ved membranfiltrering i et standard vakuumfilter med en 0,2 μm membran. Fjern resterende NaIO4 ved at vaske 3x med 50 ml PB-buffer. Resuspender den oxiderede agarose i 50 ml PB-buffer.
BEMÆRK VENLIGST: Smelt ikke agarosen i denne stage. Agarosen kan opbevares ved 4 °C i op til 2-3 uger beskyttet mod lys. - Forbered borhydridopløsning ved at tilsætte 19 g borax og 3 g borsyre til 1 L vand. Rør indtil det er opløst og juster pH til 9-9,5 med 1 M NaOH. Opvarm 100 ml boratbuffer til 40 °C på en omrøringsplade i et stinkskab. Tilsæt 0,2 g NaBH4 og rør i 15-30 min, mens du beskytter mod lys.
BEMÆRK VENLIGST: Borhydridopløsningen kan opbevares i flere uger ved stuetemperatur i mørke. Kritisk trin: Når NaBH4 tilsættes boratbufferen, dannes der gas, og udfør derfor dette trin inde i et stinkskab. Udfør ikke dette trin i en tæt forseglet beholder, da det kan føre til en eksplosion. - Tag væv ud af fryseren efter tilstrækkelig inkubation for reduceret autofluorescens (≥ 3 dage), fjern overskydende kryobeskyttende opbevaringsbuffer, og vask vævet 3x i 10 minutter hver med PB-buffer med rystning ved 40 rpm ved stuetemperatur (RT).
- Smelt ca. 20 ml oxideret agarosesuspension (tilberedt i trin 1) i en mikrobølgeovn (700 W i ~30 s), lad det køle af nok til at håndtere (~45 °C), og hæld det i en plastform.
BEMÆRK VENLIGST: Kritisk trin: Tilsæt ikke agarosen direkte efter opvarmning i mikrobølgeovnen på prøven, dette kan føre til ødelæggelse af vævet. - Brug en pincet til forsigtigt at samle vævet op og indsætte det hurtigt i bunden af agarosen. Inkuber formen ved RT i 15 minutter for at lade agarosen polymerisere.
- Efter agarosepolymerisation skal du åbne plastformen med en skalpel fra dens fire hjørner og forsigtigt tage agaroseterningen op med handskede fingre.
- Prøven nedsænkes i borhydridopløsning (tilberedt i trin 2) i 2-3 timer ved 4 °C for at påbegynde tværbinding af den oxiderede agarose og vævet. Dette forhindrer vævet i at løsne sig under sektionering.
BEMÆRK: Kritisk trin: Den nedsænkede prøve i borhydrid skal inkuberes beskyttet mod lys ved 4 °C. - Vask agaroseterningen med PB-buffer 2x i 10 min. Drej agarose-terningen, så vævet er på oversiden, og fastgør blokken til et magnetisk objektglas (mikroskopglas med to magneter fastgjort til bagsiden) ved hjælp af et par dråber øjeblikkeligt klæbemiddel. Det tager 10-20 minutter for limen at størkne, så læg en papirserviet med dråber PB-buffer oven på agarosen, hvilket sikrer, at prøven forbliver tilstrækkeligt hydreret hele vejen igennem (figur 1C).
3. Forberedelse af mikrotomen og opsætning af scenen
- Placer den magnetiske slæde på metallet i midten af prøveboksen på tomografen.
- Fyld kassen med PB-buffer og placer den forsigtigt på scenen og spænd skruen til venstre for at fastgøre prøveboksen på scenen af tomografen.
BEMÆRK VENLIGST: Spænd ikke skruerne for meget, da det vil beskadige plastikkassen. - Placer bladet på mikrotomet og flyt positionen af sample forsigtigt nær og under mikrotomet. Den øverste overflade af agarosen skal være på samme niveau som mikrotomets blad.
BEMÆRK VENLIGST: Hvis du placerer den for lavt, spilder du skæretid, mens hvis du placerer den for højt, fjernes en stor del af blokken ved første snit. - Flyt scenen for at placere agarose-terningen til midten af målet, og klik gentagne gange på Slice-knappen i tomografsoftwaren, indtil du får en intakt skive af hele agarose-terningen.
4. Allokering af overfladen og optagelse af 2D-billeder
- Centrer objektivlinsen på vævsprøven i x- og y-retninger.
- Åbn lasersoftwaren, og tænd for laseren i softwaren. Når du hører en tikkende lyd, skal du tænde for laserkontakten og justere bølgelængden til 800 nm.
BEMÆRK VENLIGST: Laserkilden skal opvarmes i mindst 30 minutter, ideelt set 1 time, før billeddannelse. - Luk mikroskopets skabsdøre, sluk for alle lyskilder i rummet, og tænd for PMT'erne og indstil spændingen til 750 V.
BEMÆRK VENLIGST: Kritisk trin: PMT'er er meget følsomme over for lys, hold det slukket, medmindre skabsdørene er lukkede, og alle lyskilder i rummet er slukket. - Juster protokolindstillingerne for tomografsoftwaren som beskrevet, og indstil mikroskoplukkeren til automatisk og voltage til 20 og 3 for henholdsvis V1 og V2.
- Klik på 2D-knappen i tomografsoftwaren for at tage et billede af prøven.
- Når et billede med synlig autofluorescens vises, skal du justere z-piezoen for at indstille brændplanet på agaroseterningens overflade. Den første scanning vil være 20 μm under overfladen for at få et stabilt billede af prøven.
- Hvis der ikke er nogen autofluorescensbaggrund synlig, skal du øge kontrasten, indtil der vises et signal. Det kan forekomme, at der ikke er noget synligt signal (dvs. på grund af agarosen oven på vævet). I dette tilfælde skal du justere z-aksen ved hjælp af z-piezo-enheden, indtil den når agaroseoverfladen. Manuel bevægelse af objektivet kan være nødvendig, hvis den ønskede position er uden for z-piezo-enhedens rækkevidde.
- Skær flere 50 μm skiver efter at have fundet overfladen af prøven, og tag 2D-billeder efter hvert snit for at sikre, at brændplanet er korrekt indstillet på blokoverfladen.
5. Find kanterne på prøverne og indstilling af laseren til udgangspunktet
- Baseret på xy-koordinaterne for laserscanningsområdet (4 hjørnekoordinater), begræns billedområdet til vævet med minimal billeddannelse af den omgivende agaroseblok.
- Sluk for PMT'erne, indstil laserbølgelængden til 800 nm, skift laserlukkeren til at åbne. Positionen af laserlys, der kommer ind i agaroseblokken, er synlig som en rød plet af spredt lys (figur 2A,B).
Kritisk trin: Vær særlig forsigtig med klasse 4-laseren. Det kan hurtigt beskadige menneskets væv og øjne. Personalet har brug for særlig uddannelse for at betjene et sådant instrument sikkert. - Brug laserpunktet, mens du flytter scenen for at finde koordinaterne for vævskanterne ved hjælp af sekvensen tilbage, højre, foran og venstre.
- Dobbelttjek koordinaterne, og placer laserpunktet i det forreste højre hjørne, som er standardudgangspunktet for billeddannelse af vævet.
- Konverter koordinaterne fra konsolvinduet til maskingenkendelige blokstørrelser, som er defineret af xy-trinene. Indtast disse trinmålinger i softwarens protokol. Luk skabsdørene.
6. 3D scanning/sektionering
- Skift bølgelængden til 940 nm for at excitere GFP, mWasabi eller YPet og PE.
BEMÆRK VENLIGST: Laseren er usynlig for det menneskelige øje ved denne bølgelængde. For at forbedre signal-til-baggrund for GFP, mWasabi og den grønne emitterende komponent i TIMERbac, skal du sætte et smalt båndpasfilter 510/20 nm foran PMT 2. Dette reducerer interferens fra grøn-gul vævsautofluorescens. - Skift mikroskoplukkeren til automatisk tilstand, og lukkerspændingsindstillingerne til 20 for V1 og 1.71 for V2.
- Juster følgende tre parametre i softwaren: Sektionstykkelse - til de fleste formål indstillet til 50 μm. For lever, indstillet til 30 μm på grund af begrænset billeddybde. Antallet af fysiske sektioner - dette bestemmer den samlede vævsdybde, der vil blive afbilledet, indstillet i overensstemmelse hermed. Antallet af fly, der skal fanges for hver sektion - dette bestemmer z-opløsningen. Brug 5 planer (giver 10 μm lodret opløsning) til de fleste formål. Til leveren skal du bruge 3 eller færre fly.
- Indstil laserforstærkningen. Dette skal testes empirisk for forskellige væv og scanningsdybde.
- Definer mappestien og navnet til lagring af de hentede billeder, og angiv relevante oplysninger til billedmetafilen.
- Dobbelttjek alle de indtastede værdier.
- Klik på 3D-mosaikindstillingen for at starte scanningsprocessen (Figur 1D).
- Når billeddannelsen er afsluttet, skal du omhyggeligt samle vævssektionerne fra vandtanken og opbevare dem i opbevaringsbuffer ved -20 °C indtil yderligere brug (figur 1E; Figur 2C,D).
7. Billedbehandling og dataanalyse
- Download MATLAB-scripts på en Linux-computer fra https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020. Kopier scripts til en mappe, f.eks. /home/user/Program/.
BEMÆRK: Computer Vision Toolbox-tilføjelsesprogrammet til MATLAB og Fiji (eller ImageJ) skal være installeret på Linux-computere, for at scriptet kan fungere fuldt ud. - Sy flisebilleder som beskrevet nedenfor.
- Overfør data fra tomografserveren til Linux-computeren.
- Åbn MATLAB-scriptet StepOneStitchingAndArchive.m, og find kildemappen, der indeholder rådataene. Definer kilde- og destinationsmapperne i scriptet.
- Skift til fanen Editor, og klik på Kør. Statusoplysninger vises i kommandovinduet. Behandlingen omfatter læsning af information fra Mosaic-filen, generering af fliseindeks før billedsyning, korrektion af baggrundsbelysning med Cidre22 (figur 3) samt belysningskorrektion mellem optiske lag optaget i forskellig dybde. Find de sammensatte billeder i en undermappe kaldet stitchedImages_100 i kildemappen. Komprimer rådataene til langtidsopbevaring ved hjælp af tar-kommandoen, og gem dem som en enkelt fil med filtypenavnet tar.bz2 (Figur 1F).
- Udfør modeltræning og segmentering med støttevektormaskine. Følg nedenstående trin for at træne støttevektormaskinen og udføre segmenteringen.
BEMÆRK VENLIGST: De sammensatte billeder for hver af de tre fluorescenskanaler gemmes i 3 undermapper (navngivet 1, 2 og 3, svarende til rød, orange og grøn fluorescens) i stitchedImages_100. Hver undermappe indeholder alle de sammensatte billeder fra den samme kanal.- Se et eksempel på de sammensatte billeder. Åbn et billede med det samme filnavn fra hver undermappe med Fiji (eller ImageJ). Flet de tre kanaler til et farvebillede. Juster lysstyrken på hver kanal, indtil der ses klare signaler fra bakterier og vævsautofluorescens. Bemærk det justerede maksimale intensitetsniveau for hver kanal for næste trin.
- Åbn MATLAB-scriptet StepTwoSegmentationAndAnalysis.m, og gå til kilden. Definer kildemappen og billednavnene til træning. For eksempel
sourceD = '/' ;
red_name = [kildeD '1/section_020_01.tif']; green_name = [kildeD '2/section_020_01.tif'];
blue_name = [kildeD '3/section_020_01.tif']; - Gå til fanen Editor, og klik på Kør.
- En dialogboks, der beder om farvetærskler vises, udfyld den baseret på tidligere manuel kontrol med Fiji (trin 7.3.1).
- Vælg regioner for baggrund og områder af interesse (dvs. bakterier) i henhold til dialogerne. Der vises grafer, der viser, hvor godt modellen er blevet trænet, og spørger, om der skal tilføjes flere regioner. Tilføj flere områder af interesse og baggrund, indtil bakterierne kan segmenteres tydeligt (figur 4A,B).
- Navngiv og gem modellen. Scriptet indlæser automatisk billederne og anvender et medianfilter (radius 2 pixels).
- Segmenteringsprocessen kører automatisk, og statusoplysninger vises i kommandovinduet. Se fremskridtene i segmenteringen. Hvis segmenteringen ikke fungerer godt med modellen på andre sammensatte billeder, skal du gentage modeltræningen for at inkludere flere baggrunds- og bakterieområder.
- Hvis du vil se resultaterne af segmenteringen, skal du kontrollere filen med navnet Allpositions_filter3D.txt. Denne fil indeholder koordinaterne for tyngdepunktet for hver bakterie eller bakteriel mikrokoloni og den tilsvarende integrerede fluorescensintensitet (figur 1G).
- Fjern yderligere artefakter med konvolutionelt neuralt netværk som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: For nogle bakterier inkluderer simpel segmentering med Support Vector Machine stadig nogle billedartefakter. Dette gælder især for YPet-udtrykte bakterier. Neural netværksbaseret segmentering kan effektivt fjerne disse artefakter (figur 4C). Tilføjelsesprogrammet Computer Vision Toolbox til MATLAB og Fiji (eller ImageJ) skal være installeret på Windows-computere, for at scriptet kan fungere fuldt ud. Du kan finde oplysninger om det underliggende neurale netværk under: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.html- Forbered billederne. Konverter tif-filer til jpg-filer med forskellige lysstyrkejusteringer ved hjælp af Fiji. Identificer med manuel kuratering mindst 600 bakterier og 600 artefakter og sikre beskårne billeder af disse objekter i passende mapper.
- Åbn MATLAB-scriptet CNNtestV4.m, og gå til kildefilerne, der indeholder objektbillederne i trin 7.4.1.
- Definer billedmappen til træning. For eksempel
digitDatasetPath = fuldfil ('D:\20200602_CNN','fortrainingPixel12Folder2');
Definer antallet af billeder til træning, f.eks. numTrainFiles = 600. - Gå til fanen Editor, og klik på Kør. Efter træning gemmes CNN-modelfilen som gregnet1.mat i kildemappen.
- Definer en mappe med testbilleder. For eksempel
digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
Resultaterne gemmes i en fil, YourFile.txt indeholder oplysninger om billednavnet og klassificeringen som bakterier eller artefakter. - Definer mappe med testbilleder. For eksempel
digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
Resultaterne gemmes i en fil YourFile.txt, som indeholder oplysninger om billednavnet og klassificeringen som bakterier eller artefakter.
- Estimer størrelsen af mikrokolonier baseret på fluorescensintensitet af enkelte bakterier som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK VENLIGST: Den rumlige opløsning af tomografen er utilstrækkelig til at opløse individuelle bakterieceller i tætpakkede mikrokolonier. Antallet af bakterier i hver mikrokoloni kan dog estimeres ud fra mikrokoloniens totale fluorescens i forhold til fluorescensen af enkelte bakterier. Denne estimeringsnøjagtighed afhænger af homogeniteten af fluorescensintensiteten på tværs af bakteriepopulationen.- Bekræft identiteten af GFP-positive hændelser i STP-tomografien ved at farve bakterielle komponenter såsom lipopolysaccharid ved hjælp af immunhistokemi af hentede sektioner fra tomografen (figur 1H; Figur 5).
- Identificer mindst 30 enkelte bakterier og hent deres fluorescensintensitet fra de tilsvarende segmenteringsresultater. Brug medianintensitetsværdien som reference for en enkelt bakterie. Bakterietallet for hver mikrokoloni beregnes ved at dividere mikrokoloniens samlede fluorescensintensitet med referenceværdien for en enkelt bakterie (figur 1I).
- Udfør 3D-rekonstruktion med visualiseringssoftware som beskrevet nedenfor.
- Forberedelse af billeder
- Tag de blå kanalbilleder, som indeholder andre harmoniske signaler af kollagen, der giver en nyttig anatomisk reference, herunder vævskapsler, arterier og trabekler. Brug billeder segmenteret for bakterier som 2. kanal.
- Læg billederne fra 1. kanal 10 gange i både x- og y-akser, og gem de reducerede billeder i en ny mappe. Lav 3 replikater af reducerede billeder i samme mappe. Navnet på nye replikater skal bevare den samme rækkefølge. For eksempel: section_001_01.tif replikere 1 med navnet section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Anvend disse trin også på billederne fra 2. kanal. Nedskæringen giver mere håndterbare filstørrelser. De tredobbelte billeder udjævner z-aksen.
- Flet billederne fra hver kanal for at danne billedstakke med Fiji. Klik på Billede > Stakke > Værktøjer > Staksortering > Sorter efter etiketter.
- Udfør 3D-filtrering. Klik på Behandl > filtre > 3D-filter, og indstil Z-filterstørrelsen til 6. Gem billedstakkene.
- Udfør 3D-visualisering som beskrevet nedenfor.
- Åbn visualiseringssoftwarepakken i Arena-visningen (standardindstilling). Brug ikonet Overvågningsmappe til at føje mapper til Arena-visningen. Dobbeltklik for at åbne filen *.ims eller *.tif (forberedt i 7.6.1).
- Brug Rediger>Billedegenskaber til at justere farvegengivelserne (LUT'er) for de forskellige kanaler i vinduet Skærmjustering.
- Klik på Avanceret for manuelt at indstille min/max-værdierne og en værdi for gammakorrektion.
Klik på kanalnavnene for at ændre navnene og LUT'erne. - Når du har justeret billedets udseende, skal du eksportere den aktuelle visning ved hjælp af snapshotværktøjet.
- Brug animationsikonet til at repræsentere 3D-dataene som en film. Brug navigationsmarkøren til at finde et perspektiv/visning og zoome, og brug + Tilføj til at tilføje keyframes. Flyt til en anden position, og tilføj den næste keyframe. Tryk på den røde optageknap for at oprette filmen. Gem den i den ønskede destinationsmappe og filtype (Figur 1J).
- Forberedelse af billeder
Representative Results
Den beskrevne procedure muliggør påvisning af individuelle Salmonella-celler i hele museorganer såsom milt, lever, mesenteriske lymfeknuder og Peyers plastre11 (figur 5 og figur 6). Det detekterer også Toxoplasma gondii-parasitter i musehjerne12. Nogle inficerede væv, herunder lever, Peyers plastre og milt, udsender betydelig autofluorescens i det grøn-gule område. Autofluorescens forstærkes yderligere ved fiksering med paraformaldehyd, hvilket er nødvendigt for at bevare vævsstrukturen. Detektion af grøn fluorescens fra GFP, mWasabi og den grønne komponent af TIMERbac mod denne autofluorescensbaggrund forbedres ved at placere et smalt båndpasfilter 510/20 nm (transmitterer de fleste GFP-emissioner, men blokerer en stor del af autofluorescensspektret) foran fotomultiplikator 2 (som opsamler grønne emissioner) og ved at reducere vævsautofluorescens ved at opbevare fast væv i 3 eller flere dage i kryobeskyttelsesmiddel11. Bakterier bør dog stadig udtrykke mindst et par tusinde kopier pr. celle af GFP eller andre fluorescerende proteiner. På den anden side bør for høje fluorescerende proteinniveauer undgås for at minimere fitnessomkostninger, der kan føre til svækket virulens23.
Korrekt segmentering af fluorescerende bakterier i vævene kan bekræftes ved immunhistokemi af udtagne vævssektioner efter billeddannelse. Specifikt kan genstande, der er farvet med et antistof mod bakterielle overfladekomponenter såsom lipopolysaccharid, justeres med fluorescensbilledet opnået ved STP-tomografi (figur 5). Det er vigtigt at bemærke, at nogle farvede Salmonella-celler mangler fluorescerende proteiner og dermed påviselig fluorescens i både konfokalmikroskopi og STP-tomografi. Disse celler er Salmonella , der er blevet dræbt af værtens immunsystem, som påvist ved flowcytometrisk sortering og vækstkulturer fra enkeltsorterede celler samt den tætte sammenhæng mellem antallet af kolonidannende enheder på agarplader og antallet af fluorescerende Salmonella-celler som bestemt ved flowcytometri24. Derudover kan plasmidtab resultere i ikke-fluorescerende levedygtige celler, og dette skal testes ved plettering på medier med og uden passende antibiotika svarende til selektionsmarkøren på plasmidet. For pSC101-afledte plasmider er plasmidtab in vivo sjældent19. For de fleste kromosomalt integrerede ekspressionskassetter såsom sifB::gfp , der bruges i11, er tab af ekspression ikke detekterbart in vivo. Hvis segmenteringen er uforenelig med immunhistokemiske data, skal segmenteringspipelinen ændres.
Opløsningen af STP-tomografi er utilstrækkelig til at opløse individuelle bakterieceller i tætpakkede mikrokolonier. Mikrokoloniens samlede fluorescensintensitet muliggør dog estimering af antallet af Salmonella-celler . Dette kræver en fluorescerende stamme med meget homogene fluorescensniveauer såsom Salmonella sifB::gfp11. Ved at kombinere det estimerede antal salmonellaceller for alle mikrokolonier og enkeltceller opnås en total bakteriel vævsbelastning, der er i overensstemmelse med alternative metoder såsom plettering eller flowcytometri af vævshomogenater11. Plettering og flowcytometri kan ikke udføres direkte fra det samme væv, fordi de skal perfusionsfikseres til STP-tomografi. I stedet skal de gøres med yderligere dyr, der ikke er fastgjort. Hvis medianbakteriebelastningen som bestemt af de forskellige tilgange afviger mere end 3 gange, kan levedygtigheden af fluorescerende bakterier blive kompromitteret (i tilfælde af lavere kolonidannende enheder), eller nogle bakterier kan have mistet den fluorescerende reporterkonstruktion (i tilfælde af højere kolonidannende enheder). Kontrolforsøg vil være nødvendige for at identificere kilden til sådanne uoverensstemmelser.
STP-tomografi giver lokalisering af bakterieceller i 3D-strukturen af det inficerede væv. De andre harmoniske signaler af kollagen giver anatomiske vartegn såsom arterier og trabekler. Derudover kan værtsceller farves in vivo ved at injicere et antistof til overflademarkører før perfusion (figur 5 og figur 6). Denne farvning giver yderligere vartegn for vævsrum og specifikke mikromiljøer, herunder inflammationsfokuser (intracellulære markører og nogle rum med diffusionsbarrierer såsom den milthvide pulpa eller hjernen er ikke let tilgængelige, egnede til denne in vivo-farvning). Denne tilgang afslørede den milthhvide pulpa som et vævsrum, der muliggør langsigtet overlevelse af Salmonella under antimikrobiel kemoterapi11.
Endelig kan Salmonella-replikation med moderate eller langsomme hastigheder identificeres og lokaliseres inden for vævets 3D-struktur ved hjælp af stammer, der udtrykker timerbac, en enkeltcellereporter for replikationshastighed11,15.
Figur 1: Procedure for helorganbilleddannelse ved hjælp af seriel to-foton (STP) tomografi. (A-B) Organet høstes efter transkardieperfusion og opbevares natten over i 4 % paraformaldehyd (PFA) ved 4 °C. (C-E) Organet indlejres i oxideret agarose og tværbindes, hvorefter vævet scannes og skæres i skiver ved hjælp af STP-tomografi. Skiverne indsamles til efterfølgende immunhistokemi. (F-J) Beregningsanalysepipelines til kvantificering af bakterietal, bekræftelse af fluorescerende bakterier og 3D-rekonstruktion af bakteriepositioner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Seriel opsætning af to-foton (STP) tomografi. (A) Tomograf, der inkorporerer (B) 2-fotonbilleddannelse med (C) automatiseret seriel vævssektion. D) Indsamlede vævsskiver til opfølgende undersøgelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Flisesømning og korrektion af belysning. Fliser sys, og ujævn belysning korrigeres for at bruge korrigerede intensitetsfordelinger ved hjælp af reguleret energiminimering (CIDRE). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Segmentering af Salmonella , der udtrykker det grønne fluorescerende protein (GFP) ved hjælp af en Support Vector Machine (SVM) og et Convolutional Neural Network (CNN). (A) Repræsentative billeder af GFP-objekter segmenteret efter SVM (venstre) og tilsvarende billeder (højre) med områder segmenteret efter SVM (skalabjælke: 10 μm). (B) Fordeling af grupperede rød-grøn-blå (RGB) værdier for de segmenterede områder. (C) Repræsentative billeder af ikke-GFP-objekter, der fejlagtigt identificeres af SVM som bakterier (til venstre). CNN afviser dem korrekt som baggrund (til højre, skala: 10 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Påvisning af Salmonella , der udtrykker det grønne fluorescerende protein (GFP) ved tomografi og bekræftelse ved immunhistokemi. Billeder af samme snit erhvervet ved tomografi (venstre) eller konfokalmikroskopi efter farvning med et antistof mod Salmonella lipopolysaccharid (højre). Neutrofiler (røde) blev farvet ved in vivo-injektion af et PE-mærket anti-Ly-6G-antistof før perfusion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: 3D-rekonstruktion og lokalisering af Salmonella i inficeret musemilt. (A) Tredimensionel (3D) rekonstruktion af en 5 mm tyk miltskive og farvet in vivo før perfusion med anti-CD169-antistof (rødt). Det blå signal repræsenterer kollagen detekteret af anden harmoniske. (B) Et optisk plan i 3D-stakken vist i (A). Positionerne af Salmonella-celler eller mikrokolonier er angivet med stjerner. (C) 3D-rekonstruktion af salmonellapositioner (stjerner) i inficeret lever. Arterierne er synlige baseret på deres kollagenskeder (blå). Skalabjælke: 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Den lokale vævskontekst af bakterielle patogener er afgørende for at bestemme lokale værtsangreb, bakterielle tilpasninger, det lokale resultat af værtspatogeninteraktioner og antimikrobiel kemoterapi og de individuelle bidrag til det samlede sygdomsresultat. Det har været en udfordring at afbilde bakterier på størrelse med mikrometer i centimeterstore organer. Seriel to-foton (STP) tomografi giver tilstrækkelig rumlig opløsning til at detektere individuelle bakterieceller i hele organer, automatiseret snitning og billeddannelse og tilstrækkelig gennemstrømning (~1 organ pr. dag)11. Mens værtsantigener kan farves in vivo, bør patogenceller udtrykke egnede fluorescerende proteiner for at sikre omfattende påvisning af intracellulære patogenceller. De resulterende datasæt (0,5-1,5 TeraByte pr. organ) udgør betydelige udfordringer for it-infrastrukturer til dataanalyse og lagring.
Der er flere kritiske trin i denne metode. For det første kræves en patogenstamme med påviselig og homogen ekspression af fluorescerende protein GFP eller YFP. Ideelt set bruges en kromosomal ekspressionskassette25 til at minimere fluorescensheterogenitet på grund af plasmidkopinummervariation. Tilstrækkelig fluorescensintensitet er påkrævet, men for høje niveauer af fluorescerende protein bør undgås for at undgå konditionsforringelse af patogenet23. Passende ekspressionsniveauer kan opnås ved valg af en passende promotor og finjustering af det ribosomale bindingssted25 eller hele det 5' utranslaterede område (UTR)26. For det andet bør perfusionsfikseringen involvere en indledende vask med buffer for at fjerne så mange erytrocytter som muligt fra blodcirkulationen. Dette er især kritisk for milt og lever (selvom fuldstændig fjernelse af erytrocytter fra disse organer er vanskelig). Resterende erytrocytter absorberer lys i den synlige del af spektret, hvilket kompromitterer billedkvaliteten27. For det tredje er opbevaring af det faste væv i kryobeskyttelsesmidlet afgørende for at reducere vævsautofluorescens, som er særlig høj i betændt væv og kan overskygge den forholdsvis svage fluorescens af patogencellerne11. For det fjerde er den effektive tværbinding af vævet til den omgivende agaroseblok afgørende for glat vibratomskæring, uden at vævet springer ud af agaroseblokken. For det femte skal fluorescerende signaler og deres identifikation som patogenceller verificeres uafhængigt ved hjælp af ortogonale tilgange såsom farvning med antistoffer mod patogenkomponenter (såsom lipopolysaccharid for gramnegative bakterier) og konfokalmikroskopi af sektionerne hentet fra tomografen11. Nogle inficerede væv indeholder autofluorescerende partikler med lignende form og overlappende fluorescensspektre, der let kan misforstås som patogenceller. For det sjette bør mængden af patogenceller i mikrokolonier sammenlignes med ortogonale tilgange såsom konfokalmikroskopi for at vurdere nøjagtigheden. De samlede bakteriebelastninger baseret på disse beregninger bør verificeres ved sammenligning med ortogonale tilgange såsom flowcytometri og plettering.
Vigtige ændringer af den udbredte STP-protokol inkluderer placering af et smalt båndpasfilter 510/20 nm foran fotomultiplikator 211 for at reducere interferens af grøn-gul autofluorescens, der er særlig stærk i inficeret og betændt lever, milt og Peyers pletter. Den stærke autofluorescens og øgede lysspredning af sådanne organer sammenlignet med hjernen (som dominerer andre anvendelser af STP) genererer også et behov for mere effektiv korrektion for ujævn belysning. Som en anden modifikation anvender denne protokol CIDRE-tilgangen22 til dette formål (figur 3) og AI-baseret segmentering af bakterier. Endelig blev vævsforbehandling ændret ved at inkludere et inkubationstrin i kryobeskyttelsesmiddel ved -20 °C, hvilket reducerer vævsautofluorescens og dermed letter påvisning af små patogenceller med relativt svag fluorescens11.
Fejlfinding kan være nødvendig, hvis ingen patogensignaler kan detekteres, eller segmentering giver utilstrækkelig følsomhed (for mange patogenceller overses) eller utilstrækkelig præcision (for mange baggrundspartikler segmenteres som patogenceller). Hvis autofluorescens i baggrundsvæv kan påvises, men der er for få patogensignaler, kan patogenerne indeholde utilstrækkelige mængder fluorescerende proteiner. Dette kan testes ved hjælp af konfokalmikroskopi af vævssnit fra samme inficerede væv eller flowcytometri af vævshomogenater19,28. Underliggende årsager kan være utilstrækkelige ekspressionsniveauer eller ustabilitet af ekspressionskassetten. Afbødningsstrategier kan omfatte alternative promotorer til at drive ekspression, kodontilpasning af de gener, der koder for det fluorescerende protein for patogenarten, anvendelse af episomale konstruktioner med højere kopiantal eller stabilisering af ekspressionskassetter ved kromosomintegration eller balanceret-dødelig komplementering29. Valget af fluorescerende protein er også vigtigt, men detektion er mulig med GFP.mut2, mWasabi, YPet og TIMERbac. Hvis segmenteringen er unøjagtig, kan dette være forårsaget af for svag patogenfluorescens, som kan behandles som beskrevet ovenfor, eller for høj vævsautofluorescensbaggrund. Omfattende perfusion af vaskeopløsning eller langvarig inkubation i opbevaringsbuffer umiddelbart før indlejring i agaroseblokken og tomografi kan løse disse problemer. Endelig kræves tilstrækkelig træning af det neurale netværk til præcis klassificering, men overdreven træning kan føre til overtilpasning, der forringer ydeevnen for nye prøver.
I øjeblikket kan ingen anden metode afbilde hele organer med tilstrækkelig rumlig opløsning i 3D til at detektere individuelle bakterier. Fremtidige forbedringer inden for vævsrensning og lysarkmikroskopi kan opnå en lignende opløsning. Dette kan muliggøre billeddannelse ved højere hastighed og med mere fluorescerende kanaler.
En vigtig begrænsning ved STP er pixelopløsningen i planet på ~0,5 μm og den vertikale opløsning på 5 til 10 μm, hvilket er utilstrækkeligt til at opløse tæt placerede bakterier, f.eks. inden for en tætpakket mikrokoloni. Det er dog muligt at hente vævssnit efter tomografi til sekundær højopløselig konfokalmikroskopi af udvalgte vævsdele. En anden begrænsning ved STP er tilgængeligheden af kun tre fluorescenskanaler, hvilket begrænser antallet af fluoroforer, der kan afbildes samtidigt. Igen kan sekundær analyse af udhentede vævssnit med multiplexing-metoder afsløre placeringen og intensiteten af mange flere markører for udvalgte vævsdele. Disse oplysninger kan integreres i den overordnede 3D-struktur af det omgivende væv som bestemt med STP.
Afslutningsvis muliggør denne protokol detaljerede undersøgelser af vært-patogen-interaktioner på lokalt og helorganniveau. Protokollen skal let kunne tilpasses andre patogener (forudsat at de kan fås som fluorescerende stammer), andre organer og forskellige værtsarter.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af Swiss National Science Foundation 310030_156818, 310030_182315 og NCCR_ 180541 AntiResist (til DB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
| Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
| Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
| Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
| Equipment | |||
| Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
| MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
| Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
| TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
| Antibody/dyes | |||
| DAPI | Merck | D9542-5MG | |
| Primary antibodies | |||
| anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
| anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
| anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | ||
| chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
| Software | Company | Version | |
| Fiji | Image J | 1.54g or later | |
| MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
| Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
| Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |
References
- Bjarnsholt, T., et al. The importance of understanding the infectious microenvironment. Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).
- Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M.
- Bumann, D., Cunrath, O. Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues. Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).
- Hofmann, J., Keppler, S. J. Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context. J Cell Sci. 134 (15), jcs258494 (2021).
- Blain, R., et al. A tridimensional atlas of the developing human head. Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).
- Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Kim, Y., et al. Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism. Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).
- Matho, K. S., et al. Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex. Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).
- Muñoz-Castañeda, R., et al. Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).
- Li, J., et al. Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118 (2021).
- Dogga, S. K., et al. Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
- Claudi, B., et al. Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy. Cell. 158 (4), 722-733 (2014).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6, 13 (2008).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Burton, N. A., et al. Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice. Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
- de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study. J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Wendland, M., Bumann, D. Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection. FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).
- Barat, S., et al. Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens. PLoS Pathog. 8 (10), e1002966 (2012).
- Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).
- Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. 5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability. Front Microbiol. 13, 1088941 (2022).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Bumann, D. Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry. Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).
- Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella. vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).
