Summary
Här beskriver vi en procedur som möjliggör organomfattande detektion av patogena bakterier under infektion och kvantifiering av fluorescerande reporteraktiviteter.
Abstract
De flesta infektioner sker i tredimensionella värdvävnader med invecklad anatomi och lokalt varierande värdfysiologi. Positioneringen av patogena celler i denna mångsidiga miljö påverkar avsevärt deras stressnivåer, svar, öde och bidrag till den övergripande utvecklingen av sjukdomen och behandlingsmisslyckandet. På grund av de tekniska svårigheterna att lokalisera μm-stora patogenceller i cm-stora värdorgan har detta forskningsområde varit relativt outforskat. Här presenterar vi en metod för att ta itu med denna utmaning. Vi använder seriell tvåfotontomografi och AI-förbättrad bildanalys för att lokalisera enskilda salmonellaceller i hela mjälten, leverloberna och hela lymfkörtlarna hos infekterade möss. Med hjälp av fluorescerande rapportörer och administrering av antikroppar in vivo kan replikationshastigheten för enskilda salmonellaceller , deras lokala interaktion med specifika immunceller och bakteriella svar på antibiotika bestämmas. Dessa metoder öppnar vägar för en omfattande undersökning av infektioner, deras förebyggande och behandling inom den tredimensionella vävnadskontexten.
Introduction
Infektioner förekommer i vävnader med komplex anatomi och uppdelad fysiologi. De olika mikromiljöer som samexisterar i den infekterade vävnaden kan bestämma ödet för lokala patogener och deras bidrag till det totala sjukdomsutfallet 1,2,3. En omfattande 3D-kartläggning av mikrobiella patogener i cm-stora vävnader är dock fortfarande en utmaning4. Avbildning av hjärnan och andra organ är ett mycket aktivt forskningsområde med ständigt förbättrade experimentella strategier5, men många metoder saknar fortfarande den sub-μm-upplösning som skulle krävas för att identifiera bakteriella patogener i μm-storlek med säkerhet. Däremot möjliggör seriell tvåfotontomografi(STP) 6 automatiserad flerfärgad, deformationsfri avbildning av hela vävnader med sub-μm upplösning i planet, vilket ger fullständiga volymetriska datamängder. Denna metod kombinerar upprepad fysisk snittning av vävnaden med hjälp av en vibratom med intermittent tvåfotonavbildning av de framväxande blockytorna med infrarött ljus. STP-tomografi har använts i stor utsträckning för att kartlägga tunna axoner i hjärnan för att fastställa konnektivitetskartor 7,8,9,10.
STP-tomografi möjliggör också 3D-kartläggning av enskilda mikrobiella patogenceller (Salmonella, Toxoplasma) i hela den infekterade vävnaden11,12 med hjälp av en tomograf. Den andra övertonsgenerationen avslöjar kollagenhöljen runt artärer och i fibrösa band som mjältens trabekler, vilket ger ett anatomiskt sammanhang. In vivo injicerade fluorescerande antikroppar kan användas för att färga värdceller för att avslöja interaktioner mellan enskilda patogena celler och infiltrerande immunceller som neutrofiler. Här beskrivs pipelinen som involverar bearbetning av vävnaden, avbildning, sammanfogning av bildplattor med belysningskorrigering, stapling av bilder i tre dimensioner och segmentering med hjälp av maskininlärningsverktyg. Denna pipeline ger 3D-positioner för enskilda patogener, celler och mikrokolonier inom deras värdkontext. Att räkna antalet enskilda celler inom mikrokolonier är fortfarande svårt på grund av upplösningsgränser, men sådana antal kan uppskattas baserat på mikrokolonins integrerade ljusstyrka. Pipelinen kan enkelt anpassas till andra infektionsmodeller om rekombinanta GFP- eller YFP-uttryckande patogener finns tillgängliga.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs här har godkänts av myndigheterna (licens 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) och följer lokala riktlinjer (Tierschutz-Verordnung, Basel) och den schweiziska djurskyddslagen (Tierschutz-Gesetz).
1. Beredning och förvaring av infekterade vävnader
- Använd en infektionsmodell som du väljer. Här infekteras 10 till 16 veckor gamla möss av båda könen med ~1 000 kolonibildande enheter (CFU) genom intravenös injektion eller 5 x 107 CFU genom intragastrisk administrering med en rundspetsnål. Lämpliga musstammar är BALB/c och C57BL/6.
OBS: Samma tillvägagångssätt kan enkelt anpassas för andra värdarter. - Se till att patogener uttrycker fluorescerande proteiner för att möjliggöra identifiering i ofärgad vävnad. Patogener som uttrycker GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15 eller mWasabi16 kan alla visualiseras med hjälp av 940 nm excitation17. Salmonella som uttrycker mCherry18 vid nivåer som lätt kan detekteras med flödescytometri19 kunde avbildas med 800 nm excitation men har dåliga signal-till-bakgrunds-förhållanden i infekterad mjälte och lever som visar betydande autofluorescens.
- Se till att alla fluorescerande proteiner behåller >70 % av sin fluorescensintensitet efter fixering med paraformaldehyd vid neutralt pH baserat på kvantifiering med flödescytometri. Här används infekterad musvävnad, nämligen mjälte, lever, lymfkörtlar och Peyers plåster.
- Färga ytmarkörer för värdceller in vivo genom att injicera fykoerytrin (PE)-märkta antikroppar 10 minuter före perfusion. För att färga neutrofiler, injicera intravenöst 4 μg anti-Ly-6G-PE i 100 μl PBS. För att färga makrofager i marginalzonen i mjälten, injicera 4 μg anti-CD169-PE i 100 μL PBS (se Materialtabell).
- Fixera infekterade vävnader genom standard transkardiell perfusion20 med 15 ml iskall 50 mM fosfatbuffert (PB; 10 mM NaH2PO4, 40 mMNa2HPO4, pH 7,4), följt av 35 ml 4 % paraformaldehyd (PFA; fixativ) i PB (figur 1A).
- I korthet, administrera djup anestesi till det infekterade djuret genom intraperitoneal injektion av 100 mg/kg ketamin och 16 mg/kg xylazin. Säkerställ korrekt bedövning genom att bekräfta förlust av tånypreflexen.
- Desinficera pälsen med 70 % etanol, torka den med en steril pappershandduk och öppna bröstet kirurgiskt med en pincett och sax. Placera en steril nål i hjärtats vänstra kammare, öppna höger förmak med en steril sax och kör den första bufferten och sedan fixeringsmedlet genom nålen, vänster kammare och hela kärlsystemet med hjälp av en pump. Detta fixerar alla vävnader snabbt och enhetligt och orsakar avlivning.
- Samla in vävnaden efter perfusion, inkubera den i 20 volymprocent av 4 % kall paraformaldehyd i PB-buffert och placera den i en shaker vid 4 °C över natten (figur 1B). Avbildning är möjlig för vävnader i storleksintervallet 0,05 till 2 cm3. För större vävnader, skär i lämpliga bitar.
- Nästa dag, tvätta näsduken 3 gånger i 10 minuter vardera med PB-buffert med skakning vid 40 rpm vid rumstemperatur för att avlägsna PFA.
OBS: På grund av PFA-toxicitet måste dessa steg utföras inuti ett dragskåp. Kassera PFA-avfallet enligt institutionella riktlinjer. - Ta bort eventuellt överflödig PB-buffert och tillsätt 20 gånger volymen kryoprotektiv lagringsbuffert21 (876 mM sackaros, 0,25 mM polyvinylpyrrolidon, 40 % (v/v) etylenglykol, upplöst i 50 mM PB-buffert) till provet genom att skaka vid 40 rpm vid 4 °C i 6-8 timmar eller tills vävnaderna sjunker till botten. Inkubera proverna vid -20 °C i minst 3 dagar för att säkerställa effektiv minskning av vävnadsautofluorescens11. Prover kan användas i upp till 5 år när de förvaras vid -20 °C.
OBS: Sjunkningen av vävnaden indikerar korrekt penetration av lagringsbufferten i vävnaden.
2. Inbäddning av prov
- Bädda in vävnaden i ett agarosblock för smidig skärning med en vibratom. Föraktivera agarosen kemiskt genom oxidation med periodat och reducera sedan med borhydrid för att bilda tvärbindning med vävnaden för förbättrad stabilitet under skärprocessen. Utför stegen som beskrivs nedan.
- Bered 4 % oxiderad agaros genom att väga 2,25 g agaros och tillsätt 0,21 g NaIO4. Tillsätt 100 ml PB till agaros och NaIO4. Rör om i rumstemperatur i ett dragskåp i 2-3 timmar med skydd mot ljus.
OBS: Kritiskt steg: Rör inte för mycket i mer än 3 timmar, annars polymeriseras agarosen dåligt. - Återvinn agarosen genom membranfiltrering i ett standardvakuumfilter med ett 0,2 μm membran. Ta bort kvarvarande NaIO4 genom att tvätta 3 gånger med 50 ml PB-buffert. Återsuspendera den oxiderade agarosen i 50 ml PB-buffert.
OBS: Smält inte agarosen under detta stage. Agaros kan förvaras vid 4 °C i upp till 2-3 veckor skyddad från ljus. - Bered borhydridlösning genom att tillsätta 19 g borax och 3 g borsyra till 1 l vatten. Rör om tills det är upplöst och justera pH till 9-9,5 med 1 M NaOH. Värm 100 ml boratbuffert till 40 °C på en omrörningsplatta i ett dragskåp. Tillsätt 0,2 g NaBH4 och rör om i 15-30 min samtidigt som du skyddar mot ljus.
OBS: Borhydridlösningen kan förvaras i flera veckor i rumstemperatur i mörker. Kritiskt steg: När NaBH4 tillsätts till boratbufferten kommer gas att bildas, utför därför detta steg inuti ett dragskåp. Gör inte detta steg i en tätt tillsluten behållare eftersom det kan leda till en explosion. - Ta vävnad från frysen efter tillräcklig inkubation för minskad autofluorescens (≥ 3 dagar), ta bort överflödig kryoprotektiv förvaringsbuffert och tvätta vävnaden 3 gånger i 10 minuter vardera med PB-buffert med skakning vid 40 rpm vid rumstemperatur (RT).
- Smält cirka 20 ml oxiderad agarossuspension (beredd i steg 1) i mikrovågsugn (700 W i ~30 s), låt den svalna tillräckligt för att hantera den (~45 °C) och häll den i en plastform.
OBS: Kritiskt steg: Tillsätt inte agarosen direkt efter att den har värmts upp i mikrovågsugnen på provet, detta kan leda till att vävnaden förstörs. - Använd en pincett för att försiktigt plocka upp näsduken och sätt snabbt in den i botten av agarosen. Inkubera formen vid RT i 15 minuter så att agarosen kan polymeriseras.
- Efter agarospolymerisation, öppna plastformen med en skalpell från dess fyra hörn och plocka försiktigt upp agaroskuben med handskbeklädda fingrar.
- Sänk ner provet i borhydridlösning (beredd i steg 2) i 2-3 timmar vid 4 °C för att initiera tvärbindning av den oxiderade agarosen och vävnaden. Detta förhindrar att vävnaden lossnar under snittningen.
OBS: Kritiskt steg: Det nedsänkta provet i borhydrid bör inkuberas skyddat från ljus vid 4 °C. - Tvätta agaroskuben med PB-buffert 2x i 10 min. Vänd agaroskuben så att vävnaden är på ovansidan och fäst blocket på ett magnetiskt objektglas (mikroskopglas med två magneter fästa på baksidan) med några droppar snabblim. Det tar 10-20 minuter för limmet att stelna, så placera en pappersnäsduk med droppar av PB-buffert ovanpå agarosen och se till att provet förblir tillräckligt hydratiserat hela tiden (Figur 1C).
3. Förberedelse av mikrotomen och förberedelse
- Placera den magnetiska sliden på metallen i mitten av provlådan på tomografen.
- Fyll lådan med PB-buffert och placera den försiktigt på stage och dra åt skruven till vänster för att säkra sample box på stage av tomografen.
OBS: Dra inte åt skruvarna för hårt, annars kommer det att skada plastlådan. - Placera bladet på mikrotomen och flytta provets position försiktigt nära och under mikrotomen. Den övre ytan av agarosen ska vara på samma nivå som mikrotomens blad.
OBS: Om du placerar den för lågt slösar du bort skärtid, medan om du placerar den för högt tar du bort en stor del av blocket vid första snittet. - Flytta scenen för att placera agaroskuben till mitten av målet och klicka upprepade gånger på Slice-knappen i tomografprogramvaran tills du får en intakt bit av hela agarosekuben.
4. Tilldelning av ytan och förvärv av 2D-bilder
- Centrera objektivlinsen på vävnadsprovet i x- och y-riktningar.
- Öppna laserprogramvaran och slå på lasern i programvaran. När du hör ett tickande ljud, slå på laserbrytaren och justera våglängden till 800 nm.
OBS: Laserkällan måste värmas upp i minst 30 minuter, helst 1 timme, innan avbildning. - Stäng skåpdörrarna till mikroskopet, stäng av alla ljuskällor i rummet och slå på PMT:erna och ställ in spänningen på 750 V.
OBS: Kritiskt steg: PMT:er är mycket känsliga för ljus, håll det avstängt om inte skåpdörrarna är stängda och alla ljuskällor i rummet är avstängda. - Justera protokollinställningarna för tomografprogramvaran enligt beskrivningen och ställ in mikroskopets slutare på automatisk och volymentage till 20 och 3 för V1 respektive V2.
- Klicka på 2D-knappen i tomografprogrammet för att ta en bild av provet.
- När en bild med synlig autofluorescens visas, justera z-piezo för att ställa in fokalplanet på agaroskubens yta. Den första skanningen kommer att ske 20 μm under ytan för att få en stabil bild av provet.
- Om ingen autofluorescensbakgrund är synlig, öka kontrasten tills en signal visas. Det kan hända att det inte finns någon synlig signal (dvs. på grund av agarosen ovanpå vävnaden). Justera i så fall z-axeln med z-piezo-enheten tills den når agarosytan. Manuell rörelse av linsen kan behövas om den önskade positionen ligger utanför räckvidden för z-piezo-enheten.
- Skär flera 50 μm skivor efter att ha hittat provets yta och ta 2D-bilder efter varje snitt för att säkerställa att fokalplanet är korrekt inställt på blockytan.
5. Hitta kanterna på proverna och ställa in lasern till startpunkten
- Baserat på xy-koordinaterna för laserskanningsområdet (4 hörnkoordinater), begränsa avbildningsområdet till vävnaden med minimal avbildning av det omgivande agarosblocket.
- Stäng av PMT:erna, ställ in laservåglängden till 800 nm, ställ om laserslutaren för att öppna. Positionen för laserljus som kommer in i agarosblocket är synlig som en röd fläck av spritt ljus (figur 2A,B).
Kritiskt steg: Var särskilt försiktig med klass 4-lasern. Det kan snabbt skada mänskliga vävnader och ögon. Personalen behöver särskild utbildning för att kunna använda ett sådant instrument på ett säkert sätt. - Använd laserpunkten medan du flyttar scenen för att hitta koordinaterna för vävnadens kanter med hjälp av sekvensen bak, höger, fram och vänster.
- Dubbelkolla koordinaterna och placera laserpunkten i det högra främre hörnet, vilket är standardutgångspunkten för avbildning av vävnaden.
- Konvertera koordinaterna från konsolfönstret till maskinigenkännbara blockstorlekar, som definieras av xy-stegen. Ange dessa stegmätningar i programvarans protokoll. Stäng skåpdörrarna.
6. 3D skanning / sektionering
- Ändra våglängden till 940 nm för att excitera GFP, mWasabi eller YPet och PE.
OBS: Lasern är osynlig för det mänskliga ögat vid denna våglängd. För att förbättra signal-till-bakgrund för GFP, mWasabi och den gröna emitterande komponenten i TIMERbac, placera ett smalt bandpassfilter 510/20 nm framför PMT 2. Detta minskar interferens av grön-gul vävnadsautofluorescens. - Växla mikroskopets slutare till automatiskt läge och slutaren voltage inställningar till 20 för V1 och 1.71 för V2.
- Justera följande tre parametrar i programvaran: Sektionstjocklek - för de flesta ändamål, inställd på 50 μm. För lever, inställd på 30 μm på grund av begränsat avbildningsdjup. Antalet fysiska sektioner - detta bestämmer det totala vävnadsdjupet som kommer att avbildas, inställt därefter. Antalet plan som ska fångas för varje sektion - detta kommer att bestämma z-upplösningen. Använd 5 plan (som ger 10 μm vertikal upplösning) för de flesta ändamål. För lever använd 3 eller färre plan.
- Ställ in laserförstärkningen. Detta måste testas empiriskt för olika vävnader och skanningsdjup.
- Definiera mappsökvägen och namnet för lagring av de inhämtade bilderna och tillhandahåll lämplig information för bildmetafilen.
- Dubbelkolla alla inmatade värden.
- Klicka på 3D-mosaikinställningen för att starta skanningsprocessen (Figur 1D).
- När avbildningen är klar, samla försiktigt in vävnadssnitten från vattentanken och förvara dem i en förvaringsbuffert vid -20 °C tills de används vidare (Figur 1E; Figur 2C,D).
7. Bildbehandling och dataanalys
- Ladda ned MATLAB-skripten på en Linux-dator från https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020. Kopiera skripten till en mapp, t.ex. /home/user/Program/.
Tillägget Computer Vision Toolbox för MATLAB och Fiji (eller ImageJ) måste installeras på Linux-datorer för att skriptet ska fungera fullt ut. - Sy ihop bilder på sidor sidor sidor som beskrivs nedan.
- Överför data från tomografservern till Linux-datorn.
- Öppna MATLAB-skriptet StepOneStitchingAndArchive.m och leta reda på källmappen som innehåller rådata. Definiera käll- och målmapparna i skriptet.
- Växla till fliken Redigerare och klicka på Kör. Förloppsinformation visas i kommandofönstret. Bearbetningen inkluderar läsning av information från Mosaic-filen, generering av kakelindex före bildsammanfogning, korrigering av bakgrundsbelysning med Cidre22 (figur 3) samt belysningskorrigering mellan optiska lager som förvärvats på olika djup. Hitta de sammanfogade bilderna i en undermapp som heter stitchedImages_100 i källmappen. Komprimera rådata för långtidslagring med hjälp av tar-kommandot och spara som en enda fil med filnamnstillägget tar.bz2 (figur 1F).
- Utför modellträning och segmentering med stödvektormaskin. Följ stegen nedan för att träna supportvektormaskinen och utföra segmenteringen.
OBS: De sammanfogade bilderna för var och en av de tre fluorescenskanalerna lagras i 3 undermappar (benämnda 1, 2 och 3, motsvarande röd, orange och grön fluorescens) på stitchedImages_100. Varje undermapp innehåller alla sammanfogade bilder från samma kanal.- Förhandsgranska de sammanfogade bilderna. Öppna en bild med samma filnamn från varje undermapp med Fiji (eller ImageJ). Slå samman de tre kanalerna till en färgbild. Justera ljusstyrkan för varje kanal tills tydliga signaler ses från bakterier och vävnadsautofluorescens. Observera den justerade maximala intensitetsnivån för varje kanal för nästa steg.
- Öppna MATLAB-skriptet StepTwoSegmentationAndAnalysis.m och bläddra till källan. Definiera källmappen och avbildningsnamnen för träning. Till exempel
sourceD = '/' ;
red_name = [källaD '1/section_020_01.tif']; green_name = [källaD '2/section_020_01.tif'];
blue_name = [källaD '3/section_020_01.tif']; - Gå till fliken Redigerare och klicka på Kör.
- En dialogruta som frågar efter färgtrösklar kommer att visas, fyll i den baserat på tidigare manuell kontroll med Fiji (steg 7.3.1).
- Välj områden för bakgrund och områden av intresse (t.ex. bakterier) enligt dialogrutorna. Diagram visas som visar hur väl modellen har tränats och frågar om fler regioner behöver läggas till. Lägg till fler områden av intresse och bakgrund tills bakterierna tydligt kan segmenteras (Figur 4A,B).
- Namnge och spara modellen. Skriptet laddar automatiskt bilderna och tillämpar ett medianfilter (radie 2 pixlar).
- Segmenteringsprocessen körs automatiskt och förloppsinformation visas i kommandofönstret. Se hur segmenteringen fortskrider. Om segmenteringen inte fungerar bra med modellen på andra sammanfogade bilder upprepar du modellträningen för att inkludera fler bakgrunds- och bakterieområden.
- Om du vill se resultatet av segmenteringen kontrollerar du filen med namnet Allpositions_filter3D.txt. Denna fil innehåller koordinaterna för tyngdpunkten för varje bakterie eller bakteriell mikrokoloni och motsvarande integrerade fluorescensintensitet (figur 1G).
- Ta bort ytterligare artefakter med faltningsneuralt nätverk enligt beskrivningen nedan.
OBS: För vissa bakterier inkluderar enkel segmentering med Support Vector Machine fortfarande vissa avbildningsartefakter. Detta gäller särskilt för YPet-uttryckande bakterier. Neural nätverksbaserad segmentering kan effektivt ta bort dessa artefakter (figur 4C). Tillägget Computer Vision Toolbox för MATLAB och Fiji (eller ImageJ) måste installeras på Windows-datorer för att skriptet ska fungera fullt ut. Information om det underliggande neurala nätverket finns i: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.html- Förbered bilderna. Konvertera tif-filer till jpg-filer med olika ljusstyrkejusteringar med Fiji. Identifiera med manuell kurering minst 600 bakterier och 600 artefakter och säkra beskurna bilder av dessa objekt i lämpliga mappar.
- Öppna MATLAB-skriptet CNNtestV4.m och bläddra till källfilerna som innehåller objektbilderna i steg 7.4.1.
- Definiera avbildningsmappen för träning. Till exempel
digitDatasetPath = fullfile ('D:\20200602_CNN','fortrainingPixel12Folder2');
Definiera antalet avbildningar för träning, t.ex. numTrainFiles = 600. - Gå till fliken Redigerare och klicka på Kör. Efter träningen sparas CNN-modellfilen som gregnet1.mat i källmappen.
- Definiera en mapp med testbilder. Till exempel
digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
Resultaten sparas i en fil YourFile.txt som innehåller information om bildens namn och klassificeringen som bakterie eller artefakt. - Definiera mapp med testbilder. Till exempel
digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp').
Resultaten sparas i en fil YourFile.txt, som innehåller information om bildens namn och klassificeringen som bakterie eller artefakt.
- Uppskatta storleken på mikrokolonier baserat på fluorescensintensiteten hos enskilda bakterier enligt beskrivningen nedan.
OBS: Den rumsliga upplösningen hos tomografen är otillräcklig för att upplösa enskilda bakterieceller i tätt packade mikrokolonier. Antalet bakterier i varje mikrokoloni kan dock uppskattas baserat på mikrokolonins totala fluorescens i förhållande till fluorescensen hos enskilda bakterier. Denna uppskattningsnoggrannhet beror på homogeniteten av fluorescensintensiteten över hela bakteriepopulationen.- Bekräfta identiteten av GFP-positiva händelser i STP-tomografin genom färgning av bakteriella komponenter såsom lipopolysackarid med hjälp av immunhistokemi av erhållna sektioner från tomografen (Figur 1H; Figur 5).
- Identifiera minst 30 enskilda bakterier och hämta deras fluorescensintensitet från motsvarande segmenteringsresultat. Använd medianintensitetsvärdet som referens för en enskild bakterie. Beräkna antalet bakterier i varje mikrokoloni genom att dividera mikrokolonins totala fluorescensintensitet med referensvärdet för en enskild bakterie (figur 1I).
- Utför 3D-rekonstruktion med visualiseringsprogram enligt beskrivningen nedan.
- Förberedelse av bild
- Ta de blå kanalbilderna, som innehåller andra harmoniska signaler av kollagen som ger en användbar anatomisk referens inklusive vävnadskapslar, artärer och trabekler. Använd bilder segmenterade för bakterier som den 2: a kanalen.
- Tunnlägg ner bilderna från 1:a kanalen 10-faldigt i både x- och y-axlarna och spara de förminskade bilderna i en ny mapp. Gör 3 kopior av förminskade bilder i samma mapp. Namnet på nya replikat ska behålla samma sekvens. Till exempel: section_001_01.tif, replikera 1 med namnet section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif. Tillämpa dessa steg även på bilderna från 2: a kanalen. Nedskalningen ger mer hanterbara filstorlekar. De tredubbla bilderna kommer att jämna ut z-axeln.
- Sammanfoga bilderna från varje kanal för att bilda bildhögar med Fiji. Klicka på Bild > Staplar > Verktyg > Staplingssorterare > Sortera efter etiketter.
- Utför 3D-filtrering. Klicka på Process- > filter > 3D-filter och ange Z-filterstorleken som 6. Spara bildhögarna.
- Utför 3D-visualisering enligt beskrivningen nedan.
- Öppna visualiseringsprogrammet i Arena-vyn (standardinställning). Använd ikonen för att bevaka mapp för att lägga till mappar i Arena-vyn. Dubbelklicka för att öppna filen *.ims eller *.tif (förberedd i 7.6.1).
- Använd Redigera>bildsegenskaper för att justera färgrepresentationerna (LUT) för de olika kanalerna i fönstret Visningsjustering.
- Klicka på Avancerat för att manuellt ställa in min/max-värdena och ett värde för gammakorrigering.
Klicka på kanalnamnen för att ändra namn och LUT. - När du har justerat bildens utseende exporterar du den aktuella vyn med hjälp av verktyget Snapshot.
- Använd animeringsikonen för att representera 3D-data som en film. Använd navigeringspekaren för att hitta ett perspektiv/en vy och zooma och använd + Lägg till för att lägga till nyckelrutor. Flytta till en annan position och lägg till nästa nyckelruta. Tryck på den röda inspelningsknappen för att bygga filmen. Spara den i önskad målmapp och filtyp (Figur 1J).
- Förberedelse av bild
Representative Results
Den beskrivna proceduren gör det möjligt att detektera enskilda salmonellaceller i hela musorgan såsom mjälte, lever, mesenteriska lymfkörtlar och Peyers plåster11 (figur 5 och figur 6). Det detekterar också Toxoplasma gondii-parasiter i mushjärna12. Vissa infekterade vävnader inklusive lever, Peyers fläckar och mjälte avger betydande autofluorescens i det grön-gula området. Autofluorescensen förstärks ytterligare genom fixering med paraformaldehyd, vilket är nödvändigt för att bevara vävnadsstrukturen. Detektion av grön fluorescens från GFP, mWasabi och den gröna komponenten av TIMERbac mot denna autofluorescensbakgrund förbättras genom att placera ett smalt bandpassfilter 510/20 nm (som överför de flesta GFP-emissioner men blockerar en stor del av autofluorescensspektrumet) framför fotomultiplikator 2 (som samlar in gröna emissioner) och genom att minska vävnadsautofluorescens genom att lagra fasta vävnader i 3 eller fler dagar i kryoprotektiv11. Bakterier bör dock fortfarande uttrycka minst några tusen kopior per cell av GFP eller andra fluorescerande proteiner. Å andra sidan bör överdrivna fluorescerande proteinnivåer undvikas för att minimera träningskostnader som kan leda till försvagad virulens23.
Korrekt segmentering av fluorescerande bakterier i vävnaderna kan bekräftas genom immunhistokemi av tillvaratagna vävnadssnitt efter avbildning. Specifikt kan föremål som färgats med en antikropp mot bakteriella ytkomponenter såsom lipopolysackarid justeras med fluorescensbilden som erhålls med STP-tomografi (figur 5). Det är viktigt att notera att vissa färgade Salmonella-celler saknar fluorescerande proteiner och därmed detekterbar fluorescens i både konfokalmikroskopi och STP-tomografi. Dessa celler är salmonella som har dödats av värdens immunsystem, vilket visats genom flödescytometrisk sortering och tillväxtkulturer från enkelsorterade celler, samt den nära korrelationen mellan antalet kolonibildande enheter på agarplattor och antalet fluorescerande salmonellaceller , bestämt med flödescytometri24. Dessutom kan plasmidförlust resultera i icke-fluorescerande livskraftiga celler och detta måste testas genom plätering på media med och utan lämpliga antibiotika motsvarande selektionsmarkören på plasmiden. För pSC101-härledda plasmider är plasmidförlust in vivo sällsynt19. För de flesta kromosomalt integrerade expressionskassetter, såsom sifB::gfp som används i11, är förlust av uttryck odetekterbar in vivo. Om segmenteringen inte stämmer överens med immunhistokemiska data måste segmenteringspipelinen ändras.
Upplösningen av STP-tomografi är otillräcklig för att lösa upp enskilda bakterieceller i tätt packade mikrokolonier. Den totala fluorescensintensiteten hos mikrokolonin gör det dock möjligt att uppskatta antalet salmonellaceller . Detta kräver en fluorescerande stam med mycket homogena fluorescensnivåer såsom Salmonella sifB::gfp11. En kombination av det uppskattade antalet salmonellaceller för alla mikrokolonier och enskilda celler ger en total mängd bakteriell vävnad som är förenlig med alternativa metoder såsom plätering eller flödescytometri av vävnadshomogenat11. Plätering och flödescytometri kan inte göras direkt från samma vävnader eftersom de måste perfusionsfixeras för STP-tomografi. Istället måste de göras med ytterligare djur som inte är fixerade. Om medianbakteriebelastningen, som bestäms av de olika metoderna, skiljer sig mer än tre gånger åt, kan livskraften hos fluorescerande bakterier äventyras (vid lägre kolonibildande enheter) eller så kan vissa bakterier ha förlorat den fluorescerande reporterkonstruktionen (vid högre kolonibildande enheter). Kontrollexperiment kommer att krävas för att identifiera källan till sådana avvikelser.
STP-tomografi ger lokalisering av bakterieceller i 3D-strukturen hos de infekterade vävnaderna. De andra harmoniska signalerna från kollagen ger anatomiska landmärken som artärer och trabekler. Dessutom kan värdceller färgas in vivo genom att injicera en antikropp mot ytmarkörer före perfusion (Figur 5 och Figur 6). Denna färgning ger ytterligare landmärken för vävnadskompartment och specifika mikromiljöer, inklusive inflammationshärdar (intracellulära markörer och vissa fack med diffusionsbarriärer som mjältens vita pulpa eller hjärnan är inte lättillgängliga, lämpliga för denna in vivo-färgning ). Detta tillvägagångssätt avslöjade den mjältvita pulpan som ett vävnadsfack som möjliggör långsiktig överlevnad av salmonella under antimikrobiell kemoterapi11.
Slutligen kan salmonella som replikeras i måttlig eller långsam hastighet identifieras och lokaliseras i 3D-strukturen av vävnader med hjälp av stammar som uttrycker timerbac, en encellsrapportör för replikeringshastighet11,15.
Figur 1: Procedur för avbildning av hela organ med hjälp av seriell tvåfotontomografi (STP). (A-B) Organet skördas efter transkardiell perfusion och förvaras över natten i 4 % paraformaldehyd (PFA) vid 4 °C. (C-E) Organet bäddas in i oxiderad agaros och tvärbinds, sedan skannas och skivas vävnaden med hjälp av STP-tomografi. Skivorna samlas in för efterföljande immunhistokemi. (F–J) Beräkningsbaserade analyspipelines för kvantifiering av bakterieantal, bekräftelse av fluorescerande bakterier och 3D-rekonstruktion av bakteriella positioner. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Inställning av seriell tvåfotontomografi (STP). (A) Tomograf som inkluderar (B) 2-fotonavbildning med (C) automatiserad seriell vävnadssnittning. D) Insamlade vävnadsskivor för uppföljande undersökningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Korrigering av kakelsömmar och belysning. Plattor sys och ojämn belysning korrigeras för att använda korrigerade intensitetsfördelningar med hjälp av regulariserad energiminimering (CIDRE). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Segmentering av salmonella som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet (GFP) med hjälp av en Support Vector Machine (SVM) och ett Convolutional Neural Network (CNN). (A) Representativa bilder av GFP-objekt segmenterade efter SVM (vänster) och motsvarande bilder (höger) med regioner segmenterade efter SVM (skalstapel: 10 μm). (B) Klustrade röd-grön-blå (RGB) värdefördelningar för de segmenterade områdena. (C) Representativa bilder av icke-GFP-objekt som felaktigt identifierats som bakterier av SVM (till vänster). CNN avfärdar dem korrekt som bakgrund (höger, skalstapel: 10 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Detektion av salmonella som uttrycker det gröna fluorescerande proteinet (GFP) genom tomografi och bekräftelse genom immunhistokemi. Bilder av samma snitt tagna med tomografi (vänster) eller konfokalmikroskopi efter infärgning med en antikropp mot Salmonella lipopolysackarid (höger). Neutrofiler (röda) färgades genom in vivo injektion av en PE-märkt anti-Ly-6G-antikropp före perfusion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: 3D-rekonstruktion och lokalisering av Salmonella i infekterad musmjälte. (A) Tredimensionell (3D) rekonstruktion av en 5 mm tjock mjältskiva och färgad in vivo före perfusion med anti-CD169-antikropp (röd). Den blå signalen representerar kollagen som detekteras av andra övertoner. (B) Ett optiskt plan av 3D-stacken som visas i (A). Salmonellacellernas eller mikrokoloniernas positioner anges av stjärnor. (C) 3D-rekonstruktion av Salmonella-positioner (stjärnor) i infekterad lever. Artärerna är synliga baserat på deras kollagenskidor (blå). Skalstreck: 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Den lokala vävnadskontexten för bakteriella patogener är avgörande för att bestämma lokala värdattacker, bakteriella anpassningar, det lokala resultatet av värdpatogeninteraktioner och antimikrobiell kemoterapi, och de individuella bidragen till det övergripande sjukdomsresultatet. Att avbilda mikrometerstora bakterier i centimeterstora organ har varit utmanande. Seriell tvåfotontomografi (STP) ger tillräcklig rumslig upplösning för att detektera enskilda bakterieceller i hela organ, automatiserad snittning och avbildning och tillräcklig genomströmning (~1 organ per dag)11. Värdantigener kan färgas in vivo, men patogena celler bör uttrycka lämpliga fluorescerande proteiner för att säkerställa omfattande detektion av intracellulära patogenceller. De resulterande datamängderna (0,5-1,5 TeraByte per organ) innebär betydande utmaningar för IT-infrastrukturer för dataanalys och lagring.
Det finns flera viktiga steg i den här metoden. Först krävs en patogenstam med detekterbart och homogent uttryck av fluorescerande protein GFP eller YFP. I idealfallet används en kromosomuttryckskassett25 för att minimera fluorescensheterogenitet på grund av variation i plasmidernas kopienummer. Tillräcklig fluorescensintensitet krävs, men för höga nivåer av fluorescerande protein bör undvikas för att undvika att patogenens kondition försämras23. Lämpliga uttrycksnivåer kan erhållas genom val av en lämplig promotor och finjustering av det ribosomala bindningsstället25 eller hela den 5' oöversatta regionen (UTR)26. För det andra bör perfusionsfixeringen innebära en initial tvätt med buffert för att avlägsna så många erytrocyter som möjligt från blodcirkulationen. Detta är särskilt viktigt för mjälte och lever (även om det är svårt att fullständigt avlägsna erytrocyter från dessa organ). Kvarvarande erytrocyter absorberar ljus i den synliga delen av spektrumet, vilket äventyrar bildkvaliteten27. För det tredje är lagring av de fasta vävnaderna i kryoprotektiviteten avgörande för att minska vävnadsautofluorescens, som är särskilt hög i inflammerade vävnader och kan överskugga den jämförelsevis svaga fluorescensen hos de patogena cellerna11. För det fjärde är den effektiva tvärbindningen av vävnaden till det omgivande agarosblocket avgörande för smidig vibratomskärning utan att vävnaden hoppar ut ur agarosblocket. För det femte måste fluorescerande signaler och deras identifiering som patogena celler verifieras oberoende med hjälp av ortogonala metoder såsom färgning med antikroppar mot patogenkomponenter (såsom lipopolysackarid för gramnegativa bakterier) och konfokalmikroskopi av de sektioner som hämtats från tomografen11. Vissa infekterade vävnader innehåller autofluorescerande partiklar med liknande form och överlappande fluorescensspektra som lätt kan misstolkas som patogena celler. För det sjätte bör mängden patogena celler i mikrokolonier jämföras med ortogonala metoder såsom konfokalmikroskopi för att bedöma noggrannheten. Den totala bakteriebelastningen baserat på dessa beräkningar bör verifieras genom jämförelse med ortogonala metoder som flödescytometri och plätering.
Viktiga modifieringar av det allmänt använda STP-protokollet inkluderar att placera ett smalt bandpassfilter 510/20 nm framför fotomultiplikatorn 211, för att minska interferensen av grön-gul autofluorescens som är särskilt stark i infekterade och inflammerade lever-, mjält- och Peyers fläckar. Den starka autofluorescensen och den ökade ljusspridningen av sådana organ jämfört med hjärnan (som dominerar andra tillämpningar av STP) genererar också ett behov av effektivare korrigering för ojämn belysning. Som en annan modifiering använder detta protokoll CIDRE-metoden22 för detta ändamål (figur 3) och AI-baserad segmentering av bakterier. Slutligen förändrades vävnadsförbehandlingen genom att inkludera ett inkubationssteg i kryoprotektiv vid -20 °C, vilket minskar vävnadens autofluorescens och därmed underlättar detektion av små patogenceller med relativt svag fluorescens11.
Felsökning kan vara nödvändig om inga patogensignaler kan detekteras, eller om segmentering ger otillräcklig känslighet (för många patogenceller missas) eller otillräcklig precision (för många bakgrundspartiklar segmenteras som patogenceller). Om autofluorescens i bakgrundsvävnad kan detekteras men det finns för få patogensignaler, kan patogenerna innehålla otillräckliga mängder fluorescerande proteiner. Detta kan testas med hjälp av konfokalmikroskopi av vävnadssnitt från samma infekterade vävnad eller flödescytometri av vävnadshomogenat19,28. Underliggande orsaker kan vara otillräckliga uttrycksnivåer eller instabilitet i uttryckskassetten. Begränsningsstrategier kan innefatta alternativa promotorer för att driva uttrycket, kodonanpassning av de gener som kodar för det fluorescerande proteinet för den patogena arten, användning av episomala konstruktioner med högre kopieantal, eller stabilisering av expressionskassetter genom kromosomal integration eller balanserad-letal komplementering29. Valet av fluorescerande protein är också viktigt, men detektion är möjlig med GFP.mut2, mWasabi, YPet och TIMERbac. Om segmenteringen är felaktig kan detta orsakas av för svag patogenfluorescens, vilket kan åtgärdas enligt beskrivningen ovan, eller för hög bakgrund av vävnadsautofluorescens. Omfattande perfusion av tvättlösning eller långvarig inkubation i lagringsbuffert omedelbart före inbäddning i agarosblocket och tomografi kan lösa dessa problem. Slutligen krävs tillräcklig träning av det neurala nätverket för exakt klassificering, men överdriven träning kan leda till överanpassning som försämrar prestandan för nya prover.
För närvarande finns det ingen annan metod som kan avbilda hela organ med tillräcklig rumslig upplösning i 3D för att detektera enskilda bakterier. Framtida förbättringar inom vävnadsrensning och light-sheet-mikroskopi kan uppnå liknande upplösning. Detta kan möjliggöra avbildning med högre hastighet och med fler fluorescerande kanaler.
En viktig begränsning av STP är pixelupplösningen i planet på ~0,5 μm och den vertikala upplösningen på 5 till 10 μm, vilket är otillräckligt för att lösa upp närbelägna bakterier, t.ex. i en tätt packad mikrokoloni. Det är dock möjligt att ta fram vävnadssnitt efter tomografi för sekundär högupplöst konfokalmikroskopi av utvalda vävnadsdelar. En annan begränsning med STP är tillgången till endast tre fluorescenskanaler, vilket begränsar antalet fluoroforer som kan avbildas samtidigt. Återigen kan sekundär analys av tillvaratagna vävnadssnitt med multiplexeringsmetoder avslöja platsen och intensiteten av många fler markörer för utvalda vävnadsdelar. Denna information kan integreras i den övergripande 3D-strukturen hos den omgivande vävnaden som bestämts med STP.
Sammanfattningsvis möjliggör detta protokoll detaljerade undersökningar av värd-patogeninteraktioner på lokal nivå och helorgannivå. Protokollet bör vara lätt att anpassa till andra patogener (förutsatt att de kan erhållas som fluorescerande stammar), andra organ och olika värdarter.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av Swiss National Science Foundation 310030_156818, 310030_182315 och NCCR_ 180541 AntiResist (till DB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
| Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
| Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
| Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
| Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
| Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
| Equipment | |||
| Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
| MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
| Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
| TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
| Antibody/dyes | |||
| DAPI | Merck | D9542-5MG | |
| Primary antibodies | |||
| anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
| anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
| anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | ||
| chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
| Software | Company | Version | |
| Fiji | Image J | 1.54g or later | |
| MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
| Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
| Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |
References
- Bjarnsholt, T., et al. The importance of understanding the infectious microenvironment. Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).
- Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M.
- Bumann, D., Cunrath, O. Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues. Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).
- Hofmann, J., Keppler, S. J. Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context. J Cell Sci. 134 (15), jcs258494 (2021).
- Blain, R., et al. A tridimensional atlas of the developing human head. Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).
- Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Kim, Y., et al. Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism. Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).
- Matho, K. S., et al. Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex. Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).
- Muñoz-Castañeda, R., et al. Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).
- Li, J., et al. Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118 (2021).
- Dogga, S. K., et al. Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
- Claudi, B., et al. Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy. Cell. 158 (4), 722-733 (2014).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6, 13 (2008).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Burton, N. A., et al. Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice. Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
- de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study. J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Wendland, M., Bumann, D. Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection. FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).
- Barat, S., et al. Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens. PLoS Pathog. 8 (10), e1002966 (2012).
- Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).
- Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. 5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability. Front Microbiol. 13, 1088941 (2022).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
- Bumann, D. Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry. Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).
- Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella. vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).
