Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

माइक्रोबियल संक्रमण के उच्च-रिज़ॉल्यूशन त्रि-आयामी पूरे-अंग टोमोग्राफी

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/66469
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biozentrum, University of Basel

Summary

यहां, हम एक ऐसी प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जो संक्रमण के दौरान रोगजनक बैक्टीरिया के अंग-व्यापी पता लगाने और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर गतिविधियों की मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाता है।

Abstract

अधिकांश संक्रमण जटिल शरीर रचना विज्ञान और स्थानीय रूप से भिन्न मेजबान शरीर विज्ञान के साथ त्रि-आयामी मेजबान ऊतकों के भीतर होते हैं। इस विविध वातावरण के भीतर रोगज़नक़ कोशिकाओं की स्थिति उनके तनाव के स्तर, प्रतिक्रियाओं, भाग्य और रोग और उपचार की विफलता की समग्र प्रगति में योगदान को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती है। हालांकि, सेमी-आकार के मेजबान अंगों के भीतर माइक्रोन आकार के रोगज़नक़ कोशिकाओं का पता लगाने में तकनीकी कठिनाइयों के कारण, अनुसंधान का यह क्षेत्र अपेक्षाकृत अस्पष्टीकृत रहा है। यहां, हम इस चुनौती को संबोधित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। हम पूरे प्लीहा, यकृत लोब और संक्रमित चूहों के पूरे लिम्फ नोड्स में व्यक्तिगत साल्मोनेला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सीरियल दो-फोटॉन टोमोग्राफी और एआई-वर्धित छवि विश्लेषण को नियोजित करते हैं। फ्लोरोसेंट पत्रकारों और विवो एंटीबॉडी प्रशासन में उपयोग करना, एकल साल्मोनेला कोशिकाओं की प्रतिकृति दर, विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ उनकी स्थानीय बातचीत, और एंटीबायोटिक दवाओं के लिए जीवाणु प्रतिक्रियाएं निर्धारित की जा सकती हैं। ये पद्धतियां तीन आयामी ऊतक संदर्भ के भीतर संक्रमण, उनकी रोकथाम और उपचार की व्यापक परीक्षा के लिए रास्ते खोलती हैं।

Introduction

संक्रमण जटिल शरीर रचना विज्ञान और कम्पार्टमेंटल शरीर विज्ञान के साथ ऊतकों में होता है। संक्रमित ऊतक में सह-अस्तित्व कि विविध microenvironments स्थानीय रोगज़नक़ सबसेट के भाग्य और समग्र रोगपरिणाम 1,2,3 के लिए उनके योगदान निर्धारित कर सकते हैं. हालांकि, सेमी आकार के ऊतकों में माइक्रोबियल रोगजनकों के व्यापक 3 डी मानचित्रण चुनौतीपूर्ण 4 बनी हुईहै. मस्तिष्क और अन्य अंगों की इमेजिंग लगातार प्रयोगात्मक रणनीतियों5 में सुधार के साथ एक अत्यधिक सक्रिय अनुसंधान क्षेत्र है, लेकिन कई तरीकों में अभी भी उप-माइक्रोन संकल्प की कमी है जो माइक्रोन आकार के जीवाणु रोगजनकों को आत्मविश्वास से पहचानने के लिए आवश्यक होगा। इसके विपरीत, सीरियल दो-फोटॉन (एसटीपी) टोमोग्राफी6 स्वचालित बहु-रंग, उप-माइक्रोन इन-प्लेन रिज़ॉल्यूशन के साथ पूरे ऊतकों की विरूपण-मुक्त इमेजिंग को सक्षम बनाता है, जिससे पूर्ण वॉल्यूमेट्रिक डेटासेट प्राप्त होते हैं। यह विधि अवरक्त प्रकाश के साथ उभरते ब्लॉक चेहरों के आंतरायिक दो-फोटॉन इमेजिंग के साथ एक कंपन का उपयोग करके ऊतक के बार-बार भौतिक सेक्शनिंग को जोड़ती है। एसटीपी टोमोग्राफी व्यापक रूप से कनेक्टिविटी नक्शे 7,8,9,10 स्थापित करने के लिए मस्तिष्क में पतली अक्षतंतु मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया है.

एसटीपी टोमोग्राफी भी एक टोमोग्राफ का उपयोग कर पूरे संक्रमित ऊतकों11,12 में व्यक्तिगत माइक्रोबियल रोगज़नक़ कोशिकाओं (साल्मोनेला, टोक्सोप्लाज्मा) के 3 डी मानचित्रण सक्षम बनाता है. दूसरी-हार्मोनिक पीढ़ी धमनियों के चारों ओर और तिल्ली के ट्रेबेकुले जैसे रेशेदार बैंड में कोलेजन म्यान को प्रकट करती है, इस प्रकार शारीरिक संदर्भ प्रदान करती है। विवो इंजेक्शन फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी में व्यक्तिगत रोगज़नक़ कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं में घुसपैठ के बीच बातचीत को प्रकट करने के लिए मेजबान कोशिकाओं को दागने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां, ऊतक के प्रसंस्करण, इमेजिंग, रोशनी सुधार के साथ इमेजिंग टाइल्स की सिलाई, तीन आयामों में छवियों के स्टैकिंग, और मशीन-लर्निंग टूल का उपयोग करके विभाजन से जुड़ी पाइपलाइन का वर्णन किया गया है। यह पाइपलाइन अपने मेजबान संदर्भ के भीतर व्यक्तिगत रोगजनकों कोशिकाओं और माइक्रोकॉलोनियों की 3 डी स्थिति पैदा करती है। माइक्रोकॉलोनियों के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं की संख्या की गणना संकल्प सीमा के कारण मुश्किल बनी हुई है, लेकिन माइक्रोकॉलोनी की एकीकृत चमक के आधार पर ऐसी संख्या का अनुमान लगाया जा सकता है। पाइपलाइन को अन्य संक्रमण मॉडल के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है यदि पुनः संयोजक जीएफपी- या वाईएफपी-व्यक्त रोगजनक उपलब्ध हैं।

Protocol

यहां वर्णित सभी पशु प्रयोगों को अधिकारियों (लाइसेंस 2239, Kantonales Veterinäramt बेसल) द्वारा अनुमोदित किया गया है और स्थानीय दिशानिर्देशों (Tierschutz-Verordnung, Basel) और स्विस पशु संरक्षण कानून (Tierschutz-Gesetz) का पालन करें।

1. संक्रमित ऊतकों की तैयारी और भंडारण

  1. पसंद के संक्रमण मॉडल का उपयोग करें। यहां, दोनों लिंगों के 10 से 16 सप्ताह पुराने चूहों को ~ 1,000 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) से अंतःशिरा इंजेक्शन या 5 x 107 सीएफयू द्वारा इंट्रागैस्ट्रिक प्रशासन द्वारा एक गोल-टिप सुई के साथ संक्रमित किया जाता है। उपयुक्त माउस उपभेदों में BALB/c और C57BL/6 शामिल हैं।
    नोट: एक ही दृष्टिकोण आसानी से अन्य मेजबान प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
  2. सुनिश्चित करें कि रोगजनकों ने बिना दाग वाले ऊतक में पहचान को सक्षम करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त किया। GFP.mut213, YPet14, TIMERbac15, या mWasabi16 व्यक्त रोगजनकों सभी 940 एनएम उत्तेजना17 का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है. साल्मोनेला प्रवाह साइटोमेट्री19 द्वारा आसानी से पता लगाने योग्य स्तरों पर mCherry18 व्यक्त 800 एनएम उत्तेजना का उपयोग कर imaged किया जा सकता है, लेकिन संक्रमित तिल्ली और जिगर जो पर्याप्त autofluorescence दिखाने में गरीब संकेत से पृष्ठभूमि अनुपात है.
  3. सुनिश्चित करें कि सभी फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रवाह साइटोमेट्री के साथ मात्रा का ठहराव के आधार पर तटस्थ पीएच पर पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ निर्धारण के बाद उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता का >70% बनाए रखते हैं। यहां, संक्रमित माउस ऊतक, अर्थात्, प्लीहा, यकृत, लिम्फ नोड्स और पीयर के पैच का उपयोग किया जाता है।
  4. छिड़काव से पहले 10 मिनट फाइकोएरिथ्रिन (पीई) -लेबल एंटीबॉडी इंजेक्शन द्वारा विवो में दाग मेजबान सेल सतह मार्कर। न्यूट्रोफिल को दागने के लिए, पीबीएस के 100 माइक्रोन में अंतःशिरा 4 माइक्रोग्राम एंटी-लाइ-6 जी-पीई इंजेक्ट करें। तिल्ली में सीमांत क्षेत्र मैक्रोफेज को दागने के लिए, पीबीएस के 100 माइक्रोन में 4 माइक्रोग्राम एंटी-सीडी 169-पीई इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. मानक ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन20 के माध्यम से संक्रमित ऊतकों को 15 एमएल बर्फ-ठंडा 50 एमएम फॉस्फेट बफर (पीबी; 10 एमएम एनएएच2पीओ4, 40 एमएमएनए2एचपीओ4, पीएच 7.4) के साथ ठीक करें, इसके बाद पीबी(चित्रा 1ए)में 4% पैराफॉर्मलाडेहाइड (पीएफए; लगानेवाला) के 35 एमएल के बाद।
    1. संक्षेप में, संक्रमित जानवर को 100 मिलीग्राम/किग्रा केटामाइन और 16 मिलीग्राम/किग्रा xylazine के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा गहरी संज्ञाहरण का प्रशासन करें। पैर की अंगुली-चुटकी पलटा के नुकसान की पुष्टि करके उचित संवेदनाहारी सुनिश्चित करें।
    2. 70% इथेनॉल का उपयोग करके फर कीटाणुरहित करें, इसे बाँझ कागज़ के तौलिये से सुखाएं, और शल्य चिकित्सा से चिमटी और कैंची से छाती खोलें। दिल के बाएं वेंट्रिकल में एक बाँझ सुई प्लेस, बाँझ कैंची के साथ सही आलिंद खुला, और पहले बफर चलाने के लिए और फिर सुई के माध्यम से लगानेवाला, छोड़ दिया निलय, और एक पंप का उपयोग पूरे संवहनी प्रणाली. यह सभी ऊतकों को तेजी से और समान रूप से ठीक करता है और इच्छामृत्यु का कारण बनता है।
  6. छिड़काव के बाद ऊतक लीजिए, इसे पीबी बफर में 4% ठंड पैराफॉर्मलडिहाइड की 20x मात्रा में इनक्यूबेट करें और इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन पर रखें(चित्र 1बी)। इमेजिंग 0.05 से 2 सेमी3 के आकार सीमा में ऊतकों के लिए संभव है। बड़े ऊतकों के लिए, उपयुक्त टुकड़ों में काट लें।
  7. अगले दिन, पीएफए को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 40 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ पीबी बफर के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए ऊतक 3x धो लें।
    नोट: पीएफए विषाक्तता के कारण, इन चरणों को एक धूआं हुड के अंदर किया जाना चाहिए। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार पीएफए अपशिष्ट का निपटान करें।
  8. किसी भी अतिरिक्त पीबी बफर निकालें और क्रायोप्रोटेक्टेंट स्टोरेज बफर21 (876 एमएम सुक्रोज, 0.25 एमएम पॉलीविनाइलपीरोलिडोन, 40% (वी/वी) एथिलीन ग्लाइकॉल, 50 एमएम पीबी बफर में भंग) की 20x मात्रा को 40 आरपीएम पर 40 आरपीएम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 6-8 घंटे के लिए या जब तक ऊतक नीचे तक नहीं डूबते। ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस11 की प्रभावी कमी सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 3 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर नमूने 5 साल तक इस्तेमाल किए जा सकते हैं।
    नोट: ऊतक का डूबना ऊतक में भंडारण बफर के उचित प्रवेश को इंगित करता है।

2. नमूना एम्बेडिंग

  1. एक कंपन के साथ चिकनी काटने के लिए एक agarose ब्लॉक में ऊतक एम्बेड करें. पीरियडेट के साथ ऑक्सीकरण द्वारा रासायनिक रूप से एगरोज को पूर्व-सक्रिय करें और फिर काटने की प्रक्रिया के दौरान बेहतर स्थिरता के लिए ऊतक के साथ क्रॉस-लिंक बनाने के लिए बोरोहाइड्राइड के साथ कम करें। नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
  2. 2.25 ग्राम agarose वजन से 4% oxidized agarose तैयार और 0.21 ग्राम NaIO4 जोड़ें. agarose और NaIO 4 करने के लिए PB के 100 एमएलजोड़ें. प्रकाश से सुरक्षा के साथ 2-3 घंटे के लिए एक धूआं हुड में कमरे के तापमान पर हिलाओ।
    नोट: महत्वपूर्ण कदम: 3 घंटे से अधिक के लिए सरगर्मी से अधिक न करें या एगारोज खराब रूप से पोलीमराइज़ करेगा।
  3. एक 0.2 माइक्रोन झिल्ली के साथ एक मानक वैक्यूम फिल्टर में झिल्ली निस्पंदन द्वारा agarose पुनर्प्राप्त. पीबी बफर के 50 एमएल के साथ 3x धोने से शेष NaIO4 निकालें। पीबी बफर के 50 एमएल में ऑक्सीकृत एगरोज को फिर से निलंबित करें।
    नोट: इस चरण के दौरान अगारोज को पिघलाएं नहीं। अगारोज को प्रकाश से संरक्षित 2-3 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. 1 लीटर पानी में 19 ग्राम बोरेक्स और 3 ग्राम बोरिक एसिड मिलाकर बोरोहाइड्राइड घोल तैयार करें। भंग होने तक हिलाओ और पीएच को 1 एम NaOH के साथ 9-9.5 पर समायोजित करें। एक धूआं हुड में एक सरगर्मी प्लेट पर, 40 डिग्री सेल्सियस करने के लिए बोरेट बफर के 100 एमएल गर्मी. 0.2 ग्राम NaBH4 जोड़ें और प्रकाश से रक्षा करते हुए 15-30 मिनट के लिए हलचल करें।
    नोट: बोरोहाइड्राइड समाधान अंधेरे में कमरे के तापमान पर कई हफ्तों तक संग्रहीत किया जा सकता है। महत्वपूर्ण कदम: बोरेट बफर में NaBH4 जोड़ते समय, गैस का गठन किया जाएगा, इसलिए इस चरण को धूआं हुड के अंदर संचालित करें। इस चरण को कसकर सील कंटेनर में न करें क्योंकि इससे विस्फोट हो सकता है।
  5. कम ऑटोफ्लोरेसेंस (≥ 3 दिन) के लिए पर्याप्त इनक्यूबेशन के बाद फ्रीजर से ऊतक लें, अतिरिक्त क्रायोप्रोटेक्टेंट स्टोरेज बफर को हटा दें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 40 आरपीएम पर झटकों के साथ पीबी बफर के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए ऊतक 3x धो लें।
  6. माइक्रोवेव में लगभग 20 एमएल ऑक्सीकृत अगारोज सस्पेंशन (चरण 1 में तैयार) पिघलाएं (~ 30 एस के लिए 700 डब्ल्यू), इसे संभालने के लिए पर्याप्त ठंडा करने की अनुमति दें (~ 45 डिग्री सेल्सियस), और इसे प्लास्टिक मोल्ड में डालें।
    नोट: महत्वपूर्ण कदम: नमूने पर माइक्रोवेव में गर्म करने के बाद सीधे एगरोज को न जोड़ें, इससे ऊतक नष्ट हो सकता है।
  7. धीरे ऊतक लेने के लिए एक चिमटी का प्रयोग करें और यह agarose के निचले केंद्र में जल्दी से डालने. 15 मिनट के लिए आरटी पर ढालना सेते हैं agarose पोलीमराइज़ करने के लिए अनुमति देने के लिए.
  8. अगारोज पोलीमराइजेशन के बाद, अपने चार कोनों से एक स्केलपेल के साथ प्लास्टिक मोल्ड खोलें और ध्यान से दस्ताने वाली उंगलियों के साथ अगारोज क्यूब उठाएं।
  9. ऑक्सीकृत एगरोज और ऊतक के क्रॉस-लिंकिंग को शुरू करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए बोरोहाइड्राइड समाधान (चरण 2 में तैयार) में नमूना विसर्जित करें। यह सेक्शनिंग के दौरान ऊतक को अलग करने से रोकता है।
    नोट: महत्वपूर्ण कदम: बोरोहाइड्राइड में डूबे हुए नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
  10. 10 मिनट के लिए पीबी बफर 2x के साथ agarose घन धो लें. ऊतक ऊपरी तरफ है कि agarose घन बारी और तत्काल चिपकने वाला की कुछ बूंदों का उपयोग कर एक चुंबकीय स्लाइड (पीठ से जुड़े दो मैग्नेट के साथ खुर्दबीन स्लाइड) के लिए ब्लॉक देते हैं. गोंद को जमने में 10-20 मिनट लगते हैं, इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना पर्याप्त रूप से हाइड्रेटेड रहता है(चित्रा 1सी)के शीर्ष पर पीबी बफर की बूंदों के साथ एक पेपर ऊतक रखें।

3. माइक्रोटोम की तैयारी और मंच की स्थापना

  1. टोमोग्राफ के नमूना बॉक्स के केंद्र में धातु पर चुंबकीय स्लाइड रखें।
  2. पीबी बफर के साथ बॉक्स भरें और ध्यान से मंच पर यह स्थिति और टोमोग्राफ के मंच पर नमूना बॉक्स सुरक्षित करने के लिए बाईं ओर पेंच कस लें.
    नोट: स्क्रू जास्त घट्ट करू नका, किंवा ते प्लास्टिक बॉक्स खराब होईल.
  3. माइक्रोटोम पर ब्लेड रखें और माइक्रोटोम के पास और नीचे नमूने की स्थिति को ध्यान से स्थानांतरित करें। अगारोज की ऊपरी सतह माइक्रोटोम के ब्लेड के समान स्तर पर होनी चाहिए।
    नोट: इसे बहुत कम पोजिशनिंग करने से काटने का समय बर्बाद हो जाएगा, जबकि इसे बहुत अधिक पोजिशन करने से पहले कट पर ब्लॉक का एक बड़ा हिस्सा निकल जाएगा।
  4. उद्देश्य के केंद्र में agarose घन स्थिति के लिए मंच ले जाएँ और आप पूरे agarose घन का एक बरकरार टुकड़ा मिल जब तक tomograph सॉफ्टवेयर में स्लाइस बटन पर बार-बार क्लिक करें.

4. सतह का आवंटन और 2 डी छवियों को प्राप्त करना

  1. ऊतक के नमूने पर उद्देश्य लेंस को एक्स- और वाई-दिशाओं में केंद्रित करें।
  2. लेजर सॉफ्टवेयर खोलें और सॉफ्टवेयर में लेजर चालू करें। टिक टिक ध्वनि सुनने पर, लेजर स्विच चालू करें, और तरंग दैर्ध्य को 800 एनएम तक समायोजित करें।
    नोट: लेजर स्रोत इमेजिंग से पहले कम से कम 30 मिनट, आदर्श 1 घंटे के लिए गर्म किया जा करने की जरूरत है.
  3. माइक्रोस्कोप के कैबिनेट दरवाजे बंद करें, कमरे में सभी प्रकाश स्रोतों को बंद करें, और पीएमटी चालू करें और वोल्टेज को 750 वी पर सेट करें।
    नोट: महत्वपूर्ण कदम: पीएमटी प्रकाश के प्रति बहुत संवेदनशील होते हैं, इसे तब तक बंद रखें जब तक कि कैबिनेट के दरवाजे बंद न हों और कमरे के सभी प्रकाश स्रोत बंद न हों।
  4. उल्लिखित के रूप में टोमोग्राफ सॉफ्टवेयर की प्रोटोकॉल सेटिंग्स समायोजित करें और माइक्रोस्कोप शटर को स्वचालित और वोल्टेज को क्रमशः V1 और V2 के लिए 20 और 3 पर सेट करें।
  5. नमूने का एक स्नैप कैप्चर करने के लिए टोमोग्राफ सॉफ़्टवेयर में 2 डी बटन पर क्लिक करें।
  6. एक बार दृश्यमान autofluorescence के साथ एक छवि प्रकट होता है, az-piezo समायोजित करने के लिए agarose घन सतह पर फोकल विमान सेट. नमूना की एक स्थिर छवि प्राप्त करने के लिए सतह के नीचे पहला स्कैन 20 माइक्रोन होगा।
    1. यदि कोई ऑटोफ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि दिखाई नहीं दे रही है, तो सिग्नल दिखाई देने तक कंट्रास्ट बढ़ाएं। यह हो सकता है कि कोई दृश्य संकेत नहीं है (यानी, ऊतक के शीर्ष पर अगारोज के कारण)। इस मामले में, z-piezo डिवाइस का उपयोग करके z-अक्ष को तब तक समायोजित करें जब तक कि यह अगारोज़ सतह तक न पहुंच जाए। लेंस के मैनुअल आंदोलन की आवश्यकता हो सकती है यदि वांछित स्थिति z-piezo डिवाइस की सीमा से बाहर है।
  7. नमूना की सतह खोजने के बाद कई 50 माइक्रोन स्लाइस काटें और फोकल विमान को ब्लॉक-फेस सतह पर ठीक से सेट करने के लिए हर कटौती के बाद 2 डी छवियां प्राप्त करें।

5. नमूनों के किनारों को ढूँढना और लेजर को शुरुआती बिंदु पर सेट करना

  1. लेजर स्कैन क्षेत्र (4 कोने निर्देशांक) के xy-निर्देशांक के आधार पर, आसपास के agarose ब्लॉक की न्यूनतम इमेजिंग के साथ ऊतक के लिए इमेजिंग क्षेत्र सीमित.
  2. पीएमटी बंद करें, लेजर तरंग दैर्ध्य को 800 एनएम पर सेट करें, लेजर शटर को खोलने के लिए स्विच करें। अगारोज ब्लॉक में प्रवेश करने वाले लेजर प्रकाश की स्थिति बिखरे हुए प्रकाश (चित्रा 2ए, बी) के लाल धब्बे के रूप में दिखाई देती है।
    महत्वपूर्ण कदम: कक्षा 4 लेजर के साथ विशेष रूप से सावधान रहें। यह तेजी से मानव ऊतकों और आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है। ऐसे उपकरण को सुरक्षित रूप से संचालित करने के लिए कर्मचारियों को विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है।
  3. अनुक्रम पीछे, दाएं, सामने, और छोड़ दिया का उपयोग कर ऊतक किनारों के निर्देशांक खोजने के लिए मंच स्थानांतरण जबकि लेजर स्पॉट का प्रयोग करें.
  4. निर्देशांक दोबारा जांचें और लेजर स्पॉट को दाएं-सामने के कोने पर रखें, जो ऊतक की इमेजिंग के लिए डिफ़ॉल्ट प्रारंभिक बिंदु है।
  5. कंसोल विंडो से निर्देशांक को मशीन-पहचानने योग्य ब्लॉक आकारों में कनवर्ट करें, जो xy-चरणों द्वारा परिभाषित किए गए हैं। सॉफ्टवेयर के प्रोटोकॉल में इन कदम मापों को दर्ज करें। कैबिनेट के दरवाजे बंद कर दें।

6. 3D स्कैनिंग /

  1. GFP, mWasabi, या YPet, और पीई उत्तेजित करने के लिए 940 एनएम के लिए तरंग दैर्ध्य बदलें.
    नोट: लेजर इस तरंग दैर्ध्य पर मानव आंख के लिए अदृश्य है। GFP, mWasabi, और TIMERबाक के हरे उत्सर्जक घटक के लिए संकेत करने के लिए पृष्ठभूमि को बढ़ाने के लिए, पीएमटी 2 के सामने एक संकीर्ण बैंड पास फिल्टर 510/20 एनएम डाल दिया. यह हरे-पीले ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस द्वारा हस्तक्षेप को कम करता है।
  2. माइक्रोस्कोप शटर को स्वचालित मोड में स्विच करें, और शटर वोल्टेज सेटिंग्स को V1 के लिए 20 और V1.71 के लिए 2 पर स्विच करें।
  3. सॉफ्टवेयर में निम्नलिखित तीन मापदंडों को समायोजित करें: अनुभाग मोटाई- अधिकांश उद्देश्यों के लिए, 50 माइक्रोन पर सेट करें। जिगर के लिए, सीमित इमेजिंग गहराई की वजह से 30 माइक्रोन करने के लिए सेट. भौतिक वर्गों की संख्या- यह कुल ऊतक गहराई है कि imaged किया जाएगा निर्धारित करता है, तदनुसार सेट. प्रत्येक खंड के लिए कब्जा करने के लिए विमानों की संख्या -यह z संकल्प निर्धारित करेगा। अधिकांश प्रयोजनों के लिए 5 विमानों (10 माइक्रोन ऊर्ध्वाधर संकल्प उपज) का प्रयोग करें। जिगर के उपयोग के लिए 3 या उससे कम विमान।
  4. लेजर लाभ सेट करें। इसे विभिन्न ऊतकों और स्कैनिंग गहराई के लिए अनुभवजन्य रूप से परीक्षण करने की आवश्यकता है।
  5. अधिग्रहीत छवियों को संग्रहीत करने के लिए फ़ोल्डर पथ और नाम को परिभाषित करें और इमेजिंग मेटाफ़ाइल के लिए उपयुक्त जानकारी प्रदान करें।
  6. सभी दर्ज किए गए मानों को दोबारा जांचें।
  7. स्कैनिंग प्रक्रिया (चित्रा 1 डी) शुरू करने के लिए 3 डी मोज़ेक सेटिंग पर क्लिक करें।
  8. इमेजिंग पूरा होने के बाद, पानी की टंकी से ऊतक वर्गों को ध्यान से इकट्ठा करें और उन्हें भंडारण बफर में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि आगे उपयोग न करें (चित्र 1ई; चित्रा 2 सी, डी)।

7. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण

  1. https://github.com/BumannLab/Li_BumannLab_2020 से लिनक्स कंप्यूटर पर MATLAB स्क्रिप्ट डाउनलोड करें। स्क्रिप्ट को एक फ़ोल्डर में कॉपी करें, उदाहरण के लिए, /home/user/Program/।
    नोट: कंप्यूटर विजन टूलबॉक्स ऐड-ऑन MATLAB और फिजी (या ImageJ) के लिए स्क्रिप्ट पूरी तरह कार्यात्मक होने के लिए लिनक्स कंप्यूटर पर स्थापित किया जाना चाहिए।
  2. नीचे वर्णित सिलाई टाइल छवियां।
    1. टोमोग्राफ सर्वर से लिनक्स कंप्यूटर पर डेटा ट्रांसफर करें।
    2. MATLAB स्क्रिप्ट StepOneStitchingAndArchive.m खोलें और कच्चे डेटा वाले स्रोत फ़ोल्डर का पता लगाएं। स्क्रिप्ट में स्रोत और गंतव्य फ़ोल्डर निर्धारित करें.
    3. संपादक टैब पर स्विच करें और चलाएँ पर क्लिक करें. प्रगति की जानकारी कमांड विंडो में प्रदर्शित होती है। प्रसंस्करण मोज़ेक फ़ाइल से जानकारी पढ़ने, छवि सिलाई से पहले टाइल सूचकांक उत्पन्न करने, Cidre22 (चित्रा 3) के साथ पृष्ठभूमि रोशनी सुधार के रूप में अच्छी तरह से अलग गहराई पर हासिल ऑप्टिकल परतों के बीच रोशनी सुधार शामिल है. स्रोत फ़ोल्डर में stitchedImages_100 नामक सबफ़ोल्डर में सिले हुए चित्र ढूंढें। टार कमांड का उपयोग करके दीर्घकालिक भंडारण के लिए कच्चे डेटा को संपीड़ित करें और फ़ाइल नाम एक्सटेंशन tar.bz2 (चित्रा 1F) के साथ एकल फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  3. समर्थन वेक्टर मशीन के साथ मॉडल प्रशिक्षण और विभाजन करें। समर्थन वेक्टर मशीन को प्रशिक्षित करने और विभाजन करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    नोट: तीन प्रतिदीप्ति चैनलों में से प्रत्येक के लिए सिले छवियों को stitchedImages_100 के 3 सबफ़ोल्डर्स (1, 2, और 3 नाम, लाल, नारंगी, और हरे रंग की प्रतिदीप्ति के अनुरूप) में संग्रहीत किया जाता है। प्रत्येक सबफ़ोल्डर में एक ही चैनल से सभी सिले हुए चित्र होते हैं।
    1. सिले हुए चित्रों का पूर्वावलोकन करें। फिजी (या इमेजजे) के साथ प्रत्येक उप-फ़ोल्डर से एक ही फ़ाइल नाम के साथ एक छवि खोलें। तीन चैनलों को एक रंगीन छवि में मर्ज करें। प्रत्येक चैनल की चमक को समायोजित करें जब तक स्पष्ट संकेत बैक्टीरिया और ऊतक autofluorescence से देखा जाता है. अगले चरण के लिए प्रत्येक चैनल के समायोजित अधिकतम तीव्रता स्तर पर ध्यान दें।
    2. MATLAB स्क्रिप्ट StepTwoSegmentationAndAnalysis.m खोलें और स्रोत के लिए ब्राउज़ करें। प्रशिक्षण के लिए स्रोत फ़ोल्डर और छवि नाम निर्धारित करें। उदाहरण के लिए
      स्रोत डी = '/' ;
      red_name = [स्रोत डी '1/section_020_01.tif']; green_name = [स्रोत डी '2/section_020_01.tif'];
      blue_name = [स्रोत डी '3/section_020_01.tif'];
    3. संपादक टैब पर जाएं और रन पर क्लिक करें।
    4. रंग थ्रेसहोल्ड के लिए पूछने वाला एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा, इसे फिजी (चरण 7.3.1) के साथ पिछले मैनुअल चेक के आधार पर भरें।
    5. संवादों के अनुसार पृष्ठभूमि और रुचि के क्षेत्रों (यानी, बैक्टीरिया) के लिए क्षेत्रों का चयन करें। ग्राफ़ दिखाते हुए दिखाई देंगे कि मॉडल को कितनी अच्छी तरह प्रशिक्षित किया गया है और पूछ रहा है कि क्या अधिक क्षेत्रों को जोड़ने की आवश्यकता है। ब्याज और पृष्ठभूमि के अधिक क्षेत्रों जोड़ें जब तक बैक्टीरिया स्पष्ट रूप से खंडित किया जा सकता है(चित्रा 4ए,बी).
    6. मॉडल को नाम दें और सहेजें। स्क्रिप्ट स्वचालित रूप से छवियों को लोड और एक औसत फिल्टर (त्रिज्या 2 पिक्सेल) लागू होगा.
    7. विभाजन प्रक्रिया स्वचालित रूप से चलती है, और प्रगति की जानकारी कमांड विंडो में दिखाई जाती है। विभाजन की प्रगति देखें। यदि विभाजन अन्य सिले छवियों पर मॉडल के साथ अच्छी तरह से काम नहीं करता है, तो अधिक पृष्ठभूमि और जीवाणु क्षेत्रों को शामिल करने के लिए मॉडल प्रशिक्षण दोहराएं।
    8. विभाजन के परिणाम देखने के लिए, Allpositions_filter3D.txt नाम की फ़ाइल देखें। इस फ़ाइल में प्रत्येक जीवाणु या बैक्टीरियल माइक्रोकॉलोनी के लिए गुरुत्वाकर्षण के केंद्र के निर्देशांक और संबंधित एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 1 जी) शामिल हैं।
  4. नीचे वर्णित के रूप में convolutional तंत्रिका नेटवर्क के साथ अतिरिक्त कलाकृतियों निकालें.
    नोट: कुछ बैक्टीरिया के लिए, समर्थन वेक्टर मशीन के साथ सरल विभाजन में अभी भी कुछ इमेजिंग कलाकृतियां शामिल हैं। यह वाईपेट-व्यक्त बैक्टीरिया के लिए विशेष रूप से सच है। तंत्रिका नेटवर्क आधारित विभाजन कुशलता से इन कलाकृतियों (चित्रा 4 सी) को दूर कर सकते हैं. कंप्यूटर विजन टूलबॉक्स ऐड-ऑन MATLAB और फिजी (या ImageJ) के लिए स्क्रिप्ट पूरी तरह कार्यात्मक होने के लिए Windows कंप्यूटर पर स्थापित किया जाना चाहिए। अंतर्निहित तंत्रिका नेटवर्क के बारे में जानकारी के लिए देखें: https://ch.mathworks.com/help/deeplearning/ug/create-simple-deep-learning-network-for-classification.html
    1. चित्र तैयार करें। फिजी का उपयोग करके विभिन्न चमक समायोजन के साथ tif फ़ाइलों को jpg फ़ाइलों में कनवर्ट करें। मैनुअल क्यूरेशन के साथ कम से कम 600 बैक्टीरिया और 600 कलाकृतियों और उपयुक्त फ़ोल्डरों में इन वस्तुओं की सुरक्षित फसली छवियों की पहचान करें।
    2. MATLAB स्क्रिप्ट CNNtestV4.m खोलें और चरण 7.4.1 की ऑब्जेक्ट छवियों वाले स्रोत फ़ाइलों के लिए ब्राउज़ करें।
    3. प्रशिक्षण के लिए छवि फ़ोल्डर को परिभाषित करें। उदाहरण के लिए
      digitDatasetPath = पूर्णफ़ाइल ('D:\20200602_CNN', 'fortrainingPixel12Folder2');
      प्रशिक्षण के लिए छवियों की संख्या को परिभाषित करें, उदाहरण के लिए, numTrainFiles = 600।
    4. संपादक टैब पर जाएं और रन पर क्लिक करें। प्रशिक्षण के बाद, CNN मॉडल फ़ाइल स्रोत फ़ोल्डर में gregnet1.mat के रूप में सहेजी जाती है।
    5. परीक्षण छवियों के साथ एक फ़ोल्डर निर्धारित करें। उदाहरण के लिए
      digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp')।
      परिणाम एक फ़ाइल YourFile.txt में सहेजे जाते हैं जिसमें छवि नाम और बैक्टीरिया या आर्टिफैक्ट के रूप में वर्गीकरण के बारे में जानकारी होती है।
    6. परीक्षण छवियों के साथ फ़ोल्डर को परिभाषित करें। उदाहरण के लिए
      digitDatasetPathTest = fullfile('D:\20200602_CNN\fortrainingPixel12Folder2\R2500G550B450yfp')।
      परिणाम एक फ़ाइल YourFile.txt में सहेजे जाएंगे, जिसमें छवि नाम और बैक्टीरिया या आर्टिफैक्ट के रूप में वर्गीकरण के बारे में जानकारी होगी।
  5. नीचे वर्णित के रूप में एकल बैक्टीरिया की प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर सूक्ष्म कालोनियों के आकार का अनुमान लगाने.
    नोट: टोमोग्राफ का स्थानिक संकल्प घनी पैक माइक्रोकॉलोनियों के भीतर व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं को हल करने के लिए अपर्याप्त है। हालांकि, प्रत्येक माइक्रोकॉलोनी में बैक्टीरिया की संख्या का अनुमान एकल बैक्टीरिया के प्रतिदीप्ति के संबंध में माइक्रोकॉलोनी के कुल प्रतिदीप्ति के आधार पर लगाया जा सकता है। यह अनुमान सटीकता बैक्टीरिया आबादी भर में प्रतिदीप्ति तीव्रता की एकरूपता पर निर्भर करता है.
    1. टोमोग्राफ से पुनर्प्राप्त वर्गों के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके लिपोपॉलेसेकेराइड जैसे जीवाणु घटकों को धुंधला करके एसटीपी टोमोग्राफी में जीएफपी-सकारात्मक घटनाओं की पहचान की पुष्टि करें (चित्रा 1एच; चित्रा 5)।
    2. कम से कम 30 एकल बैक्टीरिया की पहचान करें और इसी विभाजन परिणामों से उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता को पुनः प्राप्त करें। एक एकल जीवाणु के संदर्भ के रूप में माध्यिका तीव्रता मूल्य का उपयोग करें। एक एकल जीवाणु (चित्रा 1 आई) के संदर्भ मूल्य द्वारा माइक्रोकॉलोनी की कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता को विभाजित करके प्रत्येक माइक्रोकॉलोनी की जीवाणु संख्या की गणना करें।
  6. नीचे वर्णित के रूप में दृश्य सॉफ्टवेयर के साथ 3 डी पुनर्निर्माण प्रदर्शन.
    1. छवि तैयार करना
      1. नीले चैनल छवियों को लें, जिसमें कोलेजन के दूसरे हार्मोनिक सिग्नल होते हैं जो ऊतक कैप्सूल, धमनियों और ट्रेबेकुले सहित एक उपयोगी शारीरिक संदर्भ प्रदान करते हैं। 2चैनल के रूप में बैक्टीरिया के लिए खंडित छवियों का प्रयोग करें.
      2. 1सेंट चैनल से छवियों को 10 गुना दोनों एक्स- और वाई-अक्षों में बिन करें और डाउनसाइज्ड छवियों को एक नए फ़ोल्डर में सहेजें। एक ही फ़ोल्डर में डाउनसाइज़्ड छवियों की 3 प्रतिकृतियाँ बनाएं। नई प्रतिकृतियों का नाम एक ही क्रम रखना चाहिए। उदाहरण के लिए: section_001_01.tif, नाम section_001_01-copy.tif, section_001_01-copy-copy.tif के साथ 1 को दोहराएं। इन चरणों को 2चैनल से छवियों पर भी लागू करें। डाउनसाइज़िंग से अधिक प्रबंधनीय फ़ाइल आकार प्राप्त होते हैं। ट्रिपल इमेज z-अक्ष को चिकना कर देंगी।
      3. फिजी के साथ छवि ढेर बनाने के लिए प्रत्येक चैनल से छवियों को मर्ज करें। स्टैक > टूल्स > स्टैक सॉर्टर लेबल द्वारा सॉर्ट करें छवि >> क्लिक करें।
      4. 3D फ़िल्टरिंग करें। 3D फ़िल्टर > फ़िल्टर > प्रक्रिया पर क्लिक करें और Z फ़िल्टर आकार को 6 के रूप में सेट करें। छवि स्टैक सहेजें।
    2. नीचे बताए अनुसार 3D दृश्यावलोकन निष्पादित करें.
      1. दृश्यावलोकन सॉफ़्टवेयर पैकेज को अखाड़ा दृश्य (डिफ़ॉल्ट सेटिंग) में खोलें. एरिना दृश्य में फ़ोल्डर जोड़ने के लिए वॉच फ़ोल्डर आइकन का उपयोग करें। *.ims या *.tif फ़ाइल (7.6.1 में तैयार) खोलने के लिए डबल क्लिक करें।
      2. संपादित करें>छवि गुणों का उपयोग करके, प्रदर्शन समायोजन विंडो में विभिन्न चैनलों के रंग प्रतिनिधित्व (एलयूटी) समायोजित करें।
      3. मैन्युअल रूप से न्यूनतम/अधिकतम मान और गामा सुधार के लिए एक मान सेट करने के लिए उन्नत पर क्लिक करें।
        नाम और LUTs बदलने के लिए चैनल के नामों पर क्लिक करें।
      4. छवि की उपस्थिति को समायोजित करने के बाद, स्नैपशॉट टूल का उपयोग करके वर्तमान दृश्य को निर्यात करें।
      5. 3D डेटा को चलचित्र के रूप में प्रस्तुत करने के लिए ऐनिमेशन चिह्न का उपयोग करें. परिप्रेक्ष्य/दृश्य ढूँढने और ज़ूम करने के लिए नेविगेशन सूचक का उपयोग करें और कीफ़्रेम जोड़ने के लिए + जोड़ें का उपयोग करें. दूसरी स्थिति में ले जाएँ और अगला कीफ़्रेम जोड़ें. मूवी बनाने के लिए रेड रिकॉर्ड बटन दबाएं। इसे वांछित गंतव्य फ़ोल्डर और फ़ाइल प्रकार (चित्रा 1 जे) पर सहेजें।

Representative Results

वर्णित प्रक्रिया प्लीहा, यकृत, मेसेंटेरिक लिम्फ नोड्स, और पीयर के पैच11(चित्रा 5 और चित्रा 6) जैसे पूरे माउस अंगों में व्यक्तिगत साल्मोनेला कोशिकाओं का पता लगाने में सक्षम बनाती है। यह भी माउस मस्तिष्क12 में Toxoplasma गोंडी परजीवी का पता लगाता है. यकृत, पीयर के पैच और प्लीहा सहित कुछ संक्रमित ऊतक हरे-पीले रंग की सीमा में पर्याप्त ऑटोफ्लोरेसेंस का उत्सर्जन करते हैं। ऑटोफ्लोरेसेंस को पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ निर्धारण द्वारा और बढ़ाया जाता है, जो ऊतक संरचना को संरक्षित करने के लिए आवश्यक है। जीएफपी, एमवसाबी, और इस ऑटोफ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि के खिलाफ टाइमरबीएसी के हरे रंग के घटक से हरी प्रतिदीप्ति का पता लगाने से एक संकीर्ण बैंडपास फिल्टर 510/20 एनएम (अधिकांश जीएफपी उत्सर्जन संचारित लेकिन ऑटोफ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम के एक बड़े हिस्से को अवरुद्ध) डालकर फोटोमल्टीप्लायर 2 (जो हरी उत्सर्जन एकत्र करता है) के सामने और क्रायोप्रोटेक्टेंट11 में 3 या अधिक दिनों के लिए निश्चित ऊतकों को संग्रहीत करके ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करके सुधार किया जाता है. हालांकि, बैक्टीरिया अभी भी GFP या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रति सेल कम से कम कुछ हजार प्रतियां व्यक्त करना चाहिए. दूसरी ओर, अत्यधिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के स्तर फिटनेस लागत है कि क्षीण विषाणु23 के लिए नेतृत्व कर सकता है को कम करने से बचा जाना चाहिए.

ऊतकों में फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के सही विभाजन इमेजिंग के बाद पुनर्प्राप्त ऊतक वर्गों के immunohistochemistry द्वारा पुष्टि की जा सकती है. विशेष रूप से, लिपोपॉलेसेकेराइड जैसे जीवाणु सतह घटकों के एंटीबॉडी के साथ दाग वाली वस्तुओं को एसटीपी टोमोग्राफी (चित्रा 5) द्वारा प्राप्त प्रतिदीप्ति छवि के साथ गठबंधन किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कुछ सना हुआ साल्मोनेला कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की कमी होती है और इस प्रकार कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और एसटीपी टोमोग्राफी दोनों में पता लगाने योग्य प्रतिदीप्ति होती है। इन कोशिकाओं साल्मोनेला है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मारे गए हैं के रूप में प्रवाह cytometric छँटाई और एकल क्रमबद्ध कोशिकाओं से विकास संस्कृतियों के रूप में अच्छी तरह से अगर प्लेटों पर कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या और फ्लोरोसेंट साल्मोनेला कोशिकाओं की संख्या के बीच घनिष्ठ संबंध के रूप में प्रवाह साइटोमेट्री24 द्वारा निर्धारित के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं. इसके अलावा, प्लाज्मिड हानि गैर फ्लोरोसेंट व्यवहार्य कोशिकाओं में परिणाम कर सकते हैं और इस प्लास्मिड पर चयन मार्कर के लिए इसी उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ और बिना मीडिया पर चढ़ाना द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए. पीएससी 101 व्युत्पन्न प्लास्मिड के लिए, विवो में प्लाज्मिड हानिदुर्लभ 19 है. 11 में उपयोग किए जाने वाले sifB::gfp जैसे अधिकांश गुणसूत्र एकीकृत अभिव्यक्ति कैसेट के लिए, विवो में अभिव्यक्ति का नुकसान ज्ञानी नहीं है। यदि विभाजन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री डेटा के साथ असंगत है, तो विभाजन पाइपलाइन को संशोधित करने की आवश्यकता है।

एसटीपी टोमोग्राफी का संकल्प घनी पैक माइक्रोकॉलोनियों के भीतर व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं को हल करने के लिए अपर्याप्त है। हालांकि, माइक्रोकॉलोनी की कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता साल्मोनेला कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने में सक्षम बनाती है। यह इस तरह के साल्मोनेला sifB के रूप में अत्यधिक समरूप प्रतिदीप्ति के स्तर के साथ एक फ्लोरोसेंट तनाव की आवश्यकता होती है::gfp 11. सभी microcolonies और एकल कोशिकाओं के लिए साल्मोनेला कोशिकाओं की अनुमानित संख्या के संयोजन इस तरह के चढ़ाना या ऊतक homogenates11 के प्रवाह साइटोमेट्री के रूप में वैकल्पिक तरीकों के साथ संगत हैं कि कुल जीवाणु ऊतक भार पैदावार. चढ़ाना और प्रवाह साइटोमेट्री सीधे एक ही ऊतकों से नहीं किया जा सकता है क्योंकि उन्हें एसटीपी टोमोग्राफी के लिए छिड़काव तय करने की आवश्यकता होती है। इसके बजाय, उन्हें अतिरिक्त जानवरों के साथ किया जाना चाहिए जो तय नहीं हैं। यदि विभिन्न दृष्टिकोणों द्वारा निर्धारित माध्यिका जीवाणु भार 3 गुना से अधिक भिन्न होते हैं, तो फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की व्यवहार्यता से समझौता किया जा सकता है (कम कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों के मामले में) या कुछ बैक्टीरिया फ्लोरोसेंट रिपोर्टर निर्माण खो सकते हैं (उच्च कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों के मामले में)। ऐसी विसंगतियों के स्रोत की पहचान करने के लिए नियंत्रण प्रयोग की आवश्यकता होगी।

एसटीपी टोमोग्राफी संक्रमित ऊतकों की 3 डी संरचना के भीतर बैक्टीरिया कोशिकाओं का स्थानीयकरण प्रदान करती है। कोलेजन के दूसरे हार्मोनिक संकेत धमनियों और ट्रेबेकुले जैसे शारीरिक स्थलों को प्रदान करते हैं। इसके अलावा, मेजबान कोशिकाओं छिड़काव (चित्रा 5 और चित्रा 6) से पहले सतह मार्करों के लिए एक एंटीबॉडी इंजेक्शन द्वारा विवो में दाग दिया जा सकता है. इस धुंधला ऊतक डिब्बों और सूजन foci सहित विशिष्ट microenvironments के लिए अतिरिक्त स्थलों प्रदान करता है (intracellular मार्करों और इस तरह के स्प्लेनिक सफेद लुगदी या मस्तिष्क के रूप में प्रसार बाधाओं के साथ कुछ डिब्बों आसानी से सुलभ नहीं हैं, vivo धुंधला में इस के लिए उपयुक्त नहीं हैं). इस दृष्टिकोण एक ऊतक डिब्बे है कि रोगाणुरोधी कीमोथेरेपी11 के दौरान साल्मोनेला के दीर्घकालिक अस्तित्व को सक्षम बनाता है के रूप में प्लीहा सफेद लुगदी का पता चला.

अंत में, साल्मोनेला मध्यम या धीमी दरों पर प्रतिकृति की पहचान की जा सकती है और ऊतकों की 3 डी संरचना के भीतर स्थानीयकृत किया जा सकता है जो टाइमरबीएसी व्यक्त करते हैं, प्रतिकृति दर11,15 के लिए एक एकल सेल रिपोर्टर।

Figure 1
चित्रा 1: सीरियल दो-फोटॉन (एसटीपी) टोमोग्राफी का उपयोग करके पूरे अंग इमेजिंग के लिए प्रक्रिया। (ए-बी) अंग को ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन के बाद काटा जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में रात भर संग्रहीत किया जाता है। (सीई) अंग ऑक्सीकृत एगरोज और क्रॉस-लिंक्ड में एम्बेडेड होता है, फिर ऊतक को स्कैन किया जाता है और एसटीपी टोमोग्राफी का उपयोग करके कटा हुआ होता है। स्लाइस बाद के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए एकत्र किए जाते हैं। (एफ-जे) "बैक्टीरियल संख्या की मात्रा निर्धारित करने, फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया की पुष्टि और बैक्टीरिया की स्थिति के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए कम्प्यूटेशनल विश्लेषण पाइपलाइन"। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सीरियल दो-फोटॉन (एसटीपी) टोमोग्राफी सेटअप। (ए) टोमोग्राफ जिसमें (बी) 2-फोटॉन इमेजिंग (सी) स्वचालित सीरियल ऊतक सेक्शनिंग के साथ शामिल है। (डी) अनुवर्ती जांच के लिए ऊतक स्लाइस एकत्र किए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: टाइल सिलाई और रोशनी सुधार। टाइलें सिले जाती हैं और नियमित ऊर्जा न्यूनीकरण (CIDRE) का उपयोग करके सही तीव्रता वितरण का उपयोग करने के लिए असमान रोशनी को ठीक किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: साल्मोनेला का विभाजन एक समर्थन वेक्टर मशीन (एसवीएम) और एक दृढ़ तंत्रिका नेटवर्क (सीएनएन) का उपयोग करके हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करता है।(ए)एसवीएम (बाएं) द्वारा खंडित जीएफपी वस्तुओं की प्रतिनिधि छवियां और एसवीएम (स्केल बार: 10 माइक्रोन) द्वारा खंडित क्षेत्रों के साथ संबंधित छवियां (दाएं)। (बी) खंडित क्षेत्रों के लिए क्लस्टर्ड लाल-हरा-नीला (आरजीबी) मूल्य वितरण। (सी) गैर-जीएफपी वस्तुओं की प्रतिनिधि छवियों को एसवीएम द्वारा बैक्टीरिया (बाएं) के रूप में गलत तरीके से पहचाना गया। सीएनएन सही ढंग से उन्हें पृष्ठभूमि के रूप में खारिज कर देता है (दाएं, स्केल बार: 10 माइक्रोन)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: टोमोग्राफी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा पुष्टि द्वारा हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने वाले साल्मोनेला का पता लगाना। साल्मोनेला लिपोपॉलेसेकेराइड (दाएं) के एंटीबॉडी के साथ धुंधला होने के बाद टोमोग्राफी (बाएं) या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहित एक ही खंड की छवियां। न्यूट्रोफिल (लाल) छिड़काव से पहले एक पीई लेबल विरोधी Ly-6G एंटीबॉडी के विवो इंजेक्शन में द्वारा दाग रहे थे. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: 3 डी पुनर्निर्माण और संक्रमित माउस प्लीहा में साल्मोनेला के स्थानीयकरण. (ए) त्रि-आयामी (3 डी) 5 मिमी मोटी प्लीहा टुकड़ा का पुनर्निर्माण और एंटी-सीडी 169 एंटीबॉडी (लाल) के साथ छिड़काव से पहले विवो में दाग दिया गया। नीला संकेत दूसरे हार्मोनिक्स द्वारा पता लगाए गए कोलेजन का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) (ए) में दिखाए गए 3 डी स्टैक का एक ऑप्टिकल विमान। साल्मोनेला कोशिकाओं या माइक्रोकॉलोनियों की स्थिति सितारों द्वारा इंगित की जाती है। (सी) संक्रमित यकृत में साल्मोनेला पदों (तारों) का 3 डी पुनर्निर्माण। धमनियां उनके कोलेजन शीथ (नीले) के आधार पर दिखाई देती हैं। स्केल बार: 1 मिमी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

बैक्टीरियल रोगजनकों का स्थानीय ऊतक संदर्भ स्थानीय मेजबान हमलों, जीवाणु अनुकूलन, मेजबान रोगज़नक़ इंटरैक्शन और रोगाणुरोधी कीमोथेरेपी के स्थानीय परिणाम और समग्र रोग परिणाम में व्यक्तिगत योगदान को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। सेंटीमीटर आकार के अंगों में माइक्रोमीटर के आकार के बैक्टीरिया की इमेजिंग चुनौतीपूर्ण रही है। सीरियल दो-फोटॉन (एसटीपी) टोमोग्राफी पूरे अंगों, स्वचालित सेक्शनिंग और इमेजिंग, और पर्याप्त थ्रूपुट (~ 1 अंग प्रति दिन)11में व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं का पता लगाने के लिए पर्याप्त स्थानिक संकल्प प्रदान करती है। जबकि मेजबान एंटीजन को विवो में दाग दिया जा सकता है, रोगज़नक़ कोशिकाओं को इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ कोशिकाओं का व्यापक पता लगाने के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करना चाहिए। परिणामी डेटा सेट (0.5-1.5 टेराबाइट प्रति अंग) डेटा विश्लेषण और भंडारण के लिए आईटी इन्फ्रास्ट्रक्चर के लिए पर्याप्त चुनौतियां पेश करते हैं।

इस विधि में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP या YFP का पता लगाने योग्य और सजातीय अभिव्यक्ति के साथ एक रोगज़नक़ तनाव की आवश्यकता है. आदर्श रूप से, एक गुणसूत्र अभिव्यक्ति कैसेट25 प्लास्मिड प्रतिलिपि संख्या भिन्नता के कारण प्रतिदीप्ति विषमता को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है. पर्याप्त प्रतिदीप्ति तीव्रता की आवश्यकता है, लेकिन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अत्यधिक स्तर रोगज़नक़23 की फिटनेस हानि से बचने के लिए बचा जाना चाहिए. उपयुक्त अभिव्यक्ति स्तर एक उपयुक्त प्रमोटर के चयन और राइबोसोमल बाध्यकारी साइट25 या पूरे 5 'untranslated क्षेत्र (यूटीआर)26के ठीक-ट्यूनिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. दूसरा, छिड़काव निर्धारण बफर के साथ एक प्रारंभिक धोने शामिल होना चाहिए रक्त परिसंचरण से संभव के रूप में कई एरिथ्रोसाइट्स को दूर करने के लिए. यह प्लीहा और यकृत के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है (हालांकि इन अंगों से पूर्ण एरिथ्रोसाइट हटाना मुश्किल है)। शेष एरिथ्रोसाइट्स इमेजिंग गुणवत्ता27 समझौता स्पेक्ट्रम के दृश्य भाग में प्रकाश अवशोषित. तीसरा, क्रायोप्रोटेक्टेंट में निश्चित ऊतकों का भंडारण ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस, जो विशेष रूप से सूजन वाले ऊतकों में उच्च है और रोगज़नक़ कोशिकाओं11 के तुलनात्मक रूप से कमजोर प्रतिदीप्ति की देखरेख कर सकता है, को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। चौथा, आसपास के agarose ब्लॉक के लिए ऊतक के प्रभावी पार जोड़ने ऊतक agarose ब्लॉक से बाहर कूद के बिना चिकनी थरथानेवाला काटने के लिए महत्वपूर्ण है. पांचवां, फ्लोरोसेंट संकेतों और रोगज़नक़ कोशिकाओं के रूप में उनकी पहचान को रोगज़नक़ घटकों (जैसे ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए लिपोपॉलेसेकेराइड) के एंटीबॉडी के साथ धुंधला होना और टोमोग्राफ11 से प्राप्त वर्गों के कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी जैसे ऑर्थोगोनल दृष्टिकोण का उपयोग करके स्वतंत्र रूप से सत्यापित किया जाना चाहिए। कुछ संक्रमित ऊतकों में समान आकार और अतिव्यापी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के साथ ऑटो-फ्लोरोसेंट कण होते हैं जिन्हें आसानी से रोगज़नक़ कोशिकाओं के रूप में गलत समझा जा सकता है। छठा, माइक्रोकॉलोनियों के भीतर रोगज़नक़ कोशिकाओं की मात्रा की तुलना सटीकता का आकलन करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी जैसे ऑर्थोगोनल दृष्टिकोणों से की जानी चाहिए। इन गणनाओं के आधार पर समग्र जीवाणु भार को प्रवाह साइटोमेट्री और चढ़ाना जैसे ऑर्थोगोनल दृष्टिकोणों की तुलना में सत्यापित किया जाना चाहिए।

व्यापक रूप से इस्तेमाल किया एसटीपी प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण संशोधनों में हरे-पीले ऑटोफ्लोरेसेंस के हस्तक्षेप को कम करने के लिए फोटोमल्टीप्लायर 211 के सामने एक संकीर्ण बैंडपास फिल्टर 510/20 एनएम रखना शामिल है जो विशेष रूप से संक्रमित और सूजन वाले यकृत, प्लीहा और पीयर के पैच में मजबूत है। मस्तिष्क की तुलना में ऐसे अंगों के मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस और बढ़े हुए प्रकाश प्रकीर्णन (जो एसटीपी के अन्य अनुप्रयोगों पर हावी है) भी असमान रोशनी के लिए अधिक प्रभावी सुधार की आवश्यकता उत्पन्न करता है। एक और संशोधन के रूप में, यह प्रोटोकॉल इस उद्देश्य (चित्रा 3) और बैक्टीरिया के एआई-आधारित विभाजन के लिए सीआईडीआरई दृष्टिकोण22 को नियोजित करता है। अंत में, ऊतक प्रीप्रोसेसिंग को -20 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोप्रोटेक्टेंट में एक इनक्यूबेशन कदम शामिल करके बदल दिया गया था जो ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करता है और इस प्रकार अपेक्षाकृत कमजोर प्रतिदीप्ति11 के साथ छोटे रोगज़नक़ कोशिकाओं का पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है।

समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है यदि कोई रोगज़नक़ संकेतों का पता नहीं लगाया जा सकता है, या विभाजन अपर्याप्त संवेदनशीलता (बहुत सारे रोगज़नक़ कोशिकाओं को याद किया जाता है) या अपर्याप्त परिशुद्धता (बहुत अधिक पृष्ठभूमि कणों को रोगज़नक़ कोशिकाओं के रूप में खंडित किया जाता है) पैदा करता है। यदि पृष्ठभूमि ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस का पता लगाया जा सकता है, लेकिन बहुत कम रोगज़नक़ संकेत हैं, तो रोगजनकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अपर्याप्त मात्रा हो सकती है। यह एक ही संक्रमित ऊतक या ऊतक समरूप19,28 के प्रवाह साइटोमेट्री से ऊतक वर्गों के फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है. अंतर्निहित कारण अपर्याप्त अभिव्यक्ति स्तर या अभिव्यक्ति कैसेट की अस्थिरता हो सकती है। शमन रणनीतियों में अभिव्यक्ति को चलाने के लिए वैकल्पिक प्रमोटर, रोगज़नक़ प्रजातियों के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन का कोडन-अनुकूलन, उच्च प्रतिलिपि संख्या के साथ एपिसोमल निर्माणों का रोजगार, या गुणसूत्र एकीकरण या संतुलित-घातक पूरकता द्वारा अभिव्यक्ति कैसेट का स्थिरीकरण शामिल हो सकताहै। फ्लोरोसेंट प्रोटीन का चुनाव भी महत्वपूर्ण है, लेकिन GFP.mut2, mWasabi, YPet, और TIMERbac के साथ पता लगाना संभव है। यदि विभाजन गलत है, तो यह बहुत कमजोर रोगज़नक़ प्रतिदीप्ति के कारण हो सकता है जिसे ऊपर वर्णित के रूप में संबोधित किया जा सकता है, या बहुत अधिक ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस पृष्ठभूमि। धोने समाधान के व्यापक छिड़काव या तुरंत agarose ब्लॉक और टोमोग्राफी में एम्बेड करने से पहले भंडारण बफर में लंबे समय तक इनक्यूबेशन इन मुद्दों को हल हो सकता है. अंत में, सटीक वर्गीकरण के लिए तंत्रिका नेटवर्क के पर्याप्त प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, लेकिन अत्यधिक प्रशिक्षण से ओवरफिटिंग हो सकती है जो नए नमूनों के लिए प्रदर्शन को बाधित करती है।

वर्तमान में, कोई अन्य विधि व्यक्तिगत बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए 3 डी में पर्याप्त स्थानिक संकल्प पर पूरे अंगों की छवि नहीं कर सकती है। ऊतक समाशोधन और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी में भविष्य में सुधार इसी तरह के संकल्प को प्राप्त हो सकता है. यह उच्च गति पर और अधिक फ्लोरोसेंट चैनलों के साथ इमेजिंग सक्षम हो सकता है.

एसटीपी की एक महत्वपूर्ण सीमा ~ 0.5 माइक्रोन का इन-प्लेन पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन और 5 से 10 माइक्रोन का ऊर्ध्वाधर रिज़ॉल्यूशन है, जो घनी पैक वाली माइक्रोकॉलोनी के भीतर निकटता से स्थित बैक्टीरिया को हल करने के लिए अपर्याप्त है। हालांकि, चयनित ऊतक भागों के माध्यमिक उच्च-रिज़ॉल्यूशन कन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए टोमोग्राफी के बाद ऊतक वर्गों को पुनः प्राप्त करना संभव है। एसटीपी की एक और सीमा केवल तीन प्रतिदीप्ति चैनलों की उपलब्धता है, जो फ्लोरोफोर्स की संख्या को प्रतिबंधित करती है जिसे एक साथ चित्रित किया जा सकता है। फिर, बहुसंकेतन तरीकों के साथ पुनर्प्राप्त ऊतक वर्गों के माध्यमिक विश्लेषण चयनित ऊतक भागों के लिए कई और मार्करों के स्थान और तीव्रता प्रकट कर सकते हैं. इस जानकारी को एसटीपी के साथ निर्धारित आसपास के ऊतक की समग्र 3 डी संरचना में एकीकृत किया जा सकता है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल स्थानीय और पूरे अंग स्तर पर मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की विस्तृत जांच को सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल आसानी से अन्य रोगजनकों के लिए अनुकूलनीय होना चाहिए (बशर्ते वे फ्लोरोसेंट उपभेदों के रूप में प्राप्त किया जा सकता है), अन्य अंगों, और विभिन्न मेजबान प्रजातियों.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

काम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन 310030_156818, 310030_182315 और NCCR_ 180541 एंटीरेसिस्ट (डीबी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Agarose Low Melt Roth Art. 6351.5 25g
Boric acid Sigma-Aldrich 6768-500G
Instant adhesive Loctite 435 Henkel
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich P5413-1kg
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP-100G
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 71321-25g
Sodium hydroxide Merck 106453
Sodium periodate Sigma-Aldrich 311448-100G
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 71640-250G
Sodium phosphate monobasic dihydrate Sigma-Aldrich 71500-1KG
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732-100g
Sucrose AppliChem A4734,1000
Tris-buffered saline (TBS) Merck T5912-1L
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1
Vacuum filtration 500 TPP TPP99250
Equipment
Blade Campden Instruments Limited  01-01-4692
MAITAI Laser Spectra-Physics
Peel away plastic mold Sigma-Aldrich E6032-1CS
TissueCyte 1000 tomograph TissueVision
Antibody/dyes
DAPI Merck D9542-5MG
Primary antibodies
anti-LPS Salmonella, rabbit Sifin REF TS 1624
anti-CD169-PE, clone 3D6.112 Biolegend  142403
anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 Biolegend  127608
Secondary antibodies Invitrogen
chicken anti-rabbit Alexa 647 Invitrogen A-21443
Software Company Version
Fiji Image J 1.54g or later
MATLAB MathWorks 2017b/2018b or later
Orchestrator (tomograph) TissueVision
Visualization software Imaris Oxford Instruments 9.9.0 or later

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bjarnsholt, T., et al. The importance of understanding the infectious microenvironment. Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).
  2. Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. The biogeography of infection revisited. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).
  3. Bumann, D., Cunrath, O. Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues. Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).
  4. Hofmann, J., Keppler, S. J. Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context. J Cell Sci. 134 (15), jcs258494 (2021).
  5. Blain, R., et al. A tridimensional atlas of the developing human head. Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).
  6. Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).
  7. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
  8. Kim, Y., et al. Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism. Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).
  9. Matho, K. S., et al. Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex. Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).
  10. Muñoz-Castañeda, R., et al. Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).
  11. Li, J., et al. Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118 (2021).
  12. Dogga, S. K., et al. Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).
  13. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).
  14. Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
  15. Claudi, B., et al. Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy. Cell. 158 (4), 722-733 (2014).
  16. Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6, 13 (2008).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  18. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  19. Burton, N. A., et al. Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice. Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).
  20. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
  21. de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study. J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).
  22. Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
  23. Wendland, M., Bumann, D. Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection. FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).
  24. Barat, S., et al. Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens. PLoS Pathog. 8 (10), e1002966 (2012).
  25. Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).
  26. Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. 5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability. Front Microbiol. 13, 1088941 (2022).
  27. Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
  28. Bumann, D. Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry. Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).
  29. Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella. vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).

Tags

पूरे अंग टोमोग्राफी उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग रोगज़नक़ स्थानीयकरण साल्मोनेला संक्रमण विवो इम्यून सेल इंटरैक्शन में एंटीबायोटिक प्रतिक्रिया
माइक्रोबियल संक्रमण के उच्च-रिज़ॉल्यूशन त्रि-आयामी पूरे-अंग टोमोग्राफी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, J., Alhayek, A., Wang, H.,… More

Li, J., Alhayek, A., Wang, H., Bumann, D. High-Resolution Three-Dimensional Whole-Organ Tomography of Microbial Infections. J. Vis. Exp. (205), e66469, doi:10.3791/66469 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter