Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Построение неравновесных метаболических сетей в нано- и микрометровых везикулах

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66627
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry, University of Groningen

Summary

Представлен протокол восстановления мембранных белков и инкапсуляции ферментов и других водорастворимых компонентов в липидных везикулах субмикронного и микрометрового размера.

Abstract

Мы представляем метод встраивания в везикулы сложных белковых сетей, включающих интегральные мембранные белки, ферменты и флуоресцентные сенсоры, с использованием очищенных компонентов. Этот метод актуален для проектирования и строительства биореакторов и исследования сложных неравновесных сетей метаболических реакций. Мы начинаем с восстановления (множественных) мембранных белков в большие униламеллярные везикулы (LUV) в соответствии с ранее разработанным протоколом. Затем мы инкапсулируем смесь очищенных ферментов, метаболитов и флуоресцентных сенсоров (флуоресцентных белков или красителей) с помощью замораживания-размораживания-экструзии и удаляем неинкорпорированные компоненты с помощью центрифугирования и/или эксклюзионной хроматографии. Производительность метаболических сетей измеряется в режиме реального времени путем мониторинга соотношения АТФ/АДФ, концентрации метаболитов, внутреннего pH или других параметров с помощью флуоресцентного считывания. Наши мембранные белкисодержащие везикулы диаметром 100-400 нм могут быть преобразованы в гигантские униламеллярные везикулы (GUV) с использованием существующих, но оптимизированных процедур. Этот подход позволяет включать растворимые компоненты (ферменты, метаболиты, сенсоры) в везикулы микрометрового размера, тем самым увеличивая объем биореакторов на порядки. Метаболическая сеть, содержащая GUV, захватывается микрофлюидными устройствами для анализа с помощью оптической микроскопии.

Introduction

Область синтетической биологии снизу вверх фокусируется на конструировании (минимальных) клеток 1,2 и метаболических биореакторов для биотехнологических 3,4 или биомедицинских целей 5,6,7,8. Конструирование синтетических клеток обеспечивает уникальную платформу, которая позволяет исследователям изучать (мембранные) белки в четко определенных условиях, имитирующих условия нативной среды, что позволяет обнаружить эмерджентные свойства и скрытые биохимические функции белков и реакционных сетей9. В качестве промежуточного шага на пути к автономно функционирующей синтетической клетке разрабатываются модули, которые улавливают основные характеристики живых клеток, такие как сохранение метаболической энергии, синтез белков и липидов, а также гомеостаз. Такие модули не только улучшают наше понимание жизни,но и имеют потенциальное применение в области медицины и биотехнологии10.

Трансмембранные белки лежат в основе практически любой метаболической сети, поскольку они транспортируют молекулы внутрь или из клетки, сигнализируют и реагируют на качество окружающей среды, а также играют многочисленные биосинтетические роли. Таким образом, инженерия метаболических модулей в синтетических клетках в большинстве случаев требует восстановления интегральных и/или периферических мембранных белков в мембранный бислой, состоящий из специфических липидов и обладающих высокой целостностью (низкой проницаемостью). Работа с этими мембранными белками сложна и требует специальных знаний и экспериментальных навыков.

Было разработано несколько методов для восстановления мембранных белков в фосфолипидных везикулах, чаще всего с целью изучения функции11,12, регуляции13, кинетических свойств14,15, липидной зависимости 15,16 и/или стабильности17 конкретного белка. Эти методы включают быстрое разведение растворимого в детергентах белка в водную среду в присутствии липидов18, удаление детергентов путем инкубации растворимого в моющем средстве белка с дестабилизированными липидными везикулами и абсорбцию детергента(ов) на гранулах полистирола19 или удаление детергентов с помощью диализа или эксклюзионной хроматографии20. Органические растворители использовались для образования липидных везикул, например, путем образования интерфаз21 нефть-вода, но большинство интегральных мембранных белков инактивируются при воздействии таких растворителей.

В нашей лаборатории мы в основном восстанавливаем мембранные белки методом детергент-абсорбции с образованием крупных униламеллярных везикул (LUV)19. Этот метод позволяет осуществлять совместное воссоздание множественных мембранных белков и инкапсуляцию в просвет везикулы ферментов, метаболитов и зондов22,23. Мембранные белки, содержащие LUV, могут быть преобразованы в гигантские униламеллярные везикулы (GUV) с инкапсуляцией водорастворимых компонентов или без нее, используя либо электрообразование24, либо гелеобразное набухание25 и специальные условия для сохранения целостности мембранных белков26.

В данной статье представлен протокол восстановления в LUV неравновесной метаболической сети, которая регенерирует АТФ путем распада L-аргинина на L-орнитин27. Образование АТФ связано с образованием глицерол-3-фосфата (G3P), важного строительного блока для синтеза фосфолипидов22,28. Метаболический путь состоит из двух интегральных мембранных белков: аргинина/орнитина (ArcD) и антипорта G3P/Pi (GlpT). Кроме того, три растворимых фермента (ArcA, ArcB, ArcC) необходимы для рециркуляции АТФ, а GlpK используется для превращения глицерина в глицерин-3-фосфат с использованием АТФ из распада L-аргинина, см. Рисунок 1 для схематического обзора пути. Этот протокол представляет собой хорошую отправную точку для будущего построения еще более сложных реакционных сетей — для синтеза липидов или белков или для деления клеток. Липидный состав везикул поддерживает активность широкого спектра интегральных мембранных белков и был оптимизирован для транспортировки различных молекул внутрь или из везикул 27,29,30.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор пути производства АТФ, синтеза и выведения глицерин-3-фосфата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Короче говоря, очищенные мембранные белки (солюбилизированные в додецил-β-D-мальтозиде, ДДМ) добавляются к предварительно сформированным липидным везикулам, которые были дестабилизированы с помощью Triton X-100, что позволяет встраивать белки в мембрану. Молекулы детергента впоследствии (медленно) удаляются путем добавления активированных гранул полистирола, что приводит к образованию хорошо запечатанных протеолипосом. Растворимые компоненты затем могут быть добавлены в везикулы и инкапсулированы с помощью циклов замораживания-оттаивания, что улавливает молекулы в процессе слияния мембран. Полученные везикулы очень неоднородны и многие из них являются многопластинчатыми. Затем они выдавливаются через поликарбонатный фильтр с размером пор 400, 200 или 100 нм, что дает пузырьки более равномерного размера; Чем меньше размер пор, тем более однородными и одноламеллярными являются везикулы, но ценой меньшего внутреннего объема. Неинкорпорированные белки и малые молекулы удаляются из наружного раствора с помощью эксклюзионной хроматографии. ПротеоЛУВ могут быть преобразованы в микрометровые везикулы путем гелеобразного набухания, а затем эти протеоГУВ собираются и удерживаются в микрофлюидном чипе для микроскопической характеристики и манипуляций. На рисунке 2 показан схематический обзор полного протокола.

Figure 2
Рисунок 2: Обзор протокола восстановления мембранных белков и инкапсуляции ферментов и водорастворимых компонентов в липидных везикулах субмикронного (LUV) и микрометрового размера (GUVs). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Протоколы восстановления и инкапсуляции работают хорошо, и функциональность белков сохраняется, но proteoLUV и proteoGUVs неоднородны по размеру. Микрофлюидные подходы31,32 позволяют формировать везикулы микрометрового размера, которые являются более однородными по размеру, но функциональное восстановление мембранных белков, как правило, невозможно, поскольку остаточный растворитель в бислое инактивирует белки. Размер протеоЛУВ колеблется от 100 до 400 нм, и при низких концентрациях ферментов инкапсуляция может привести к образованию везикул с неполными метаболическими путями (стохастические эффекты; см. рис. 3). LUV идеально подходят для создания определенных метаболических модулей, как показано здесь для производства АТФ и строительных блоков, таких как G3P. Такие proteoLUV потенциально могут быть инкапсулированы в GUV и служить органеллоподобными компартментами для везикул хозяина.

Figure 3
Рисунок 3: Количество молекул в везикуле диаметром 100, 200 или 400 нм. (А) Когда инкапсулированные белки (ферменты, зонды) находятся в диапазоне от 1 до 10 мкМ. (В) Восстановление осуществляется при концентрации от 1 до 1 000, от 1 до 10 000 и от 1 до 100 000 мембранных белков на липид (моль/моль). Мы исходим из предположения, что молекулы инкапсулируются в указанных концентрациях и встраиваются в мембрану при этих соотношении белка к липидам. Что касается некоторых ферментов, то мы видели, что они связываются с мембранами, что может увеличивать их видимую концентрацию в везикулах. Аббревиатура: LPR = Lipid-Protein-Ratio Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Общая подготовка

  1. Химикалии
    1. Растворите липиды (в виде порошка) до 25 мг/мл в CHCl3 для получения предварительно сформированных липосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно готовить свежие липидные запасы, но исходные растворы также могут храниться при температуре -20 °C в течение нескольких недель. Работа с липидами в виде порошка более точна, чем с использованием уже растворенных в CHCl3 липидов. CHCl3 следует обрабатывать с помощью стеклянных пипеток и/или шприцев и хранить в стеклянных контейнерах, так как CHCl3 растворяет пластик.
    2. Растворите малые молекулы (нуклеотиды, аминокислоты, флуоресцентные зонды) для процедуры инкапсуляции в 50 мМ KPi (буфер А, см. таблицу 1) и отрегулируйте pH до 7,00 ± 0,01. Растворите MgCl2в деионизированной воде, чтобы избежать образования осадков фосфата магния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные растворы могут храниться при температуре -20 °C в течение нескольких недель, за исключением DTT, который готовится свежим в день эксперимента.
    3. Растворить ионофоры (например, валиномицин, нигерицин) в ДМСО или ЭтОН в исходной концентрации 100-500 мкМ. Хранить при -20 °С в течение нескольких недель; не допускать испарения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДМСО не является энергозависимым и поэтому предпочтительнее EtOH. Используйте стеклянные вместо пластиковых флаконов во избежание прилипания ионофоров к поверхности флаконов.
  2. Буферов
    1. Приготовьте свежие буферы в день эксперимента (табл. 1). Не храните дольше 24 часов.
  3. Очистка растворимых белков
    1. Express ArcA, ArcB, ArcC (мы используем конкретный вариант под названием ArcC1), PercevalHR и GlpK, как описано ранее 27,28,33. Обязательно добавьте 10% v/v глицерина в буфер для лизиса клеток, который повышает стабильность белков. Очистите растворимые белки, как описанов пунктах 27,28,33 и кратко описано ниже.
    2. Разморозьте 10 мл клеточного лизата (~5 г сырого веса) на водяной бане. Тем временем нанесите 2 мл (1 CV) Ni2+-сефарозной смолы на колонну самотечного потока (емкость 20 мл) с деионизированной водой (12 CV) и буфером B (4 CV) для промывки. Переложите талый лизат в лед; работа на льду, если не указано иное.
    3. Добавьте имидазол до конечной концентрации 10 мМ в талый лизат, затем вылейте раствор на колонну гравитационного потока. Выдерживать в течение 1 часа при температуре 4 °C с легким оттенком.
    4. Через 1 час сбросить поток и промыть смолу буфером C (20 CVs).
    5. Разбавьте белок буфером D. Используйте 60% CV для первого этапа элюирования, затем 4-6 этапов 40% CV.
    6. Определите концентрацию белка и добавьте Na-ЭДТА до конечной концентрации 5 мМ.
    7. Уменьшите обороты очищенного белка в охлаждаемой настольной центрифуге (максимальная скорость, 10 минут, 4 °C). Очистите методом эксклюзионной хроматографии с использованием буфера E. Объедините фракции элюирования и сконцентрируйте их до ~10 мг/мл с помощью концентрационного фильтра с отсечкой 30 кДа. Приготовьте аликвоты соответствующего размера (~ 20 μл), мгновенно заморозьте жидким азотом и храните при температуре -80 °C для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно концентрировать ферменты до 50-100 μМ, чтобы свести к минимуму объем, необходимый для инкапсуляции.
  4. Очистка мембранных белков
    1. Overexpress ArcD и GlpT, как описано ранее 22,27,33. Обязательно добавьте 10% v/v глицерина в буфер для лизиса клеток; Для очистки ArcD добавьте в буфер 2 мМ восстановителя (например, DTT). Очистите белки, помеченные аффинностью, с помощью хроматографии Ni2+-сефарозы.
      1. Разморозьте аликвоту сырых мембранных пузырьков (10-20 мг общего мембранного белка) в ванне с ледяной водой.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После размораживания всегда работайте на льду, если не указано иное. Буферы, используемые в этом разделе, приведены в таблице 1 .
      2. Добавьте мембранные везикулы в буфер F (ArcD) или буфер G (GlpT) до конечного объема 6 мл. Инкубируйте образец в течение 1 ч при температуре 4 °C с щадящей нутацией.
      3. Отделите солюбилизированные мембранные белки от обломков мембраны с помощью ультрацентрифугирования (337 000 × г, 30 мин, 4 °C). Тем временем нанесите 0,25 мл (1 CV) смолы Ni2+-сефарозы на столб самотечного потока (емкость 10 мл) с деионизированной водой (40 CVs) и 20 CV буфера H (ArcD) или буфера I (GlpT).
      4. Вылейте растворимый белок на колонну гравитационного потока и добавьте имидазол до конечной концентрации 10 мМ. Инкубировать в течение 1 ч при температуре 4 °C с легким оттенком.
      5. Через 1 ч сбросить проточный слой и промыть смолу 20 CV буфера J (ArcD) или буфера K (GlpT).
      6. Элюируйте мембранный белок с шагом 60% CV (1-й) и 40% CV (2-6-й) с помощью буфера L (ArcD) или буфера M (GlpT).
      7. Определите концентрацию белка и перейдите к разделу 2.2. для восстановления мембраны.
        Примечание: Исключение из размера очистки не обязательно проводится для мембранных белков, поскольку восстановление мембраны дает аналогичную очистку. Шаги 1.4 и 2.2 можно выполнить за 1 день работы. Начните с очистки белка (шаг 1.4) утром и продолжайте восстановлением (шаг 2.2) во второй половине дня. Восстановление заканчивается на следующий день (подробнее см. раздел 2.2). ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Очищенные и растворенные в DDM ArcD и GlpT можно хранить при температуре -80 °C для последующего использования, но это верно не для всех мембранных белков. Приготовьте аликвоты соответствующего размера (50-200 мкл), мгновенно заморозьте жидким азотом и храните при температуре -80 °C для последующего использования. Эти белки активны в течение нескольких месяцев при хранении при -80 °C в присутствии 10% v/v глицерина.
  5. Получение β-казеина с целью пассивации
    1. Ресуспендируйте 100 мг β-казеина в 20 мл деионизированной воды и титруйте 1 М NaOH до полного растворения β-казеина. Затем добавьте 1 М уксусной кислоты, чтобы довести pH до 7,0, и заполните объем до 50 мл деионизированной водой. Отфильтруйте раствор через шприцевой фильтр 0,2 мкм и сделайте аликвоты по 500 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: β-казеин можно хранить при температуре -20 °C в течение 6 месяцев. Перед использованием рекомендуется повторно отфильтровать β-казеин, чтобы избежать засорения микрофлюидного чипа агрегатами β-казеина.

Буфер Состав
Буфер А 50 мМ KPi pH 7,0
Буфер B 50 мМ KPi, 100 мМ KCl, 10% v/v глицерина, 10 мМ имидазола, pH 7,5
Буфер C 50 мМ KPi, 100 мМ KCl, 10% v/v глицерин, 50 мМ имидазола, pH 7,5
Буфер D 50 мМ KPi, 100 мМ KCl, 10% v/v глицерин, 500 мМ имидазола, pH 7,5
Буфер E 50 мМ KPi, 100 мМ KCl, 10% v/v глицерин, pH 7,0
Буфер F 50 мМ KPi, 100 мМ KCl, 0,5% по объему ДДМ, 10% по объему глицерина, 2 мМ β-меркаптоэтанола, pH 7,5
Буфер G 50 мМ Tris-HCl, 0,5% по сравнению с ДДМ, 20% по сравнению с глицерином, pH 8
Буфер H 50 мМ KPi, 100 мМ KCl, 0,02% мас./об., 10% v/v глицерин, 2 мМ β-меркаптоэтанол, 10 мМ имидазола, pH 7,5
Буфер I 50 мМ Трис-HCl, 0,04% по сравнению с ДДМ, 20% по сравнению с глицерином, 10 мМ имидазола, pH 8,0
Буфер J 50 мМ KPi, 200 мМ KCl, 0,02% по объему ДДМ, 10% по объему глицерина, 2 мМ β-меркаптоэтанол, 50 мМ имидазола, pH 7,5
Буфер K 50 мМ Трис-HCl, 0,04% по сравнению с ДДМ, 20% по сравнению с глицерином, 50 мМ имидазола, pH 8
Буфер L 50 мМ KPi, 200 мМ KCl, 0,02% w/v ДДМ, 10% v/v глицерин, 2 мМ β-меркаптоэтанол, 500 мМ имидазола, pH 7,5
Буфер М 50 мМ Трис-HCl, 0,04% по сравнению с ДДМ, 20% по сравнению с глицерином, 500 мМ имидазола, pH 8
Буфер N 50 мМ KPi, 58 мМ NaCl, 2 мМ DTT, pH 7,0
Буфер O 50 мМ KPi, 0,5 мМ L-орнитин, 10 мМ Na-ADP, 10 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, pH 7,0
Буфер P 50 мМ KPi pH 7,0, 2 мМ DTT, x мМ глюкоза (x варьируется в соответствии с осмолярностью внешней и внутренней среды)
Буфер Q 50 мМ KPi pH 7,0, 0,5 мМ сахароза, 2 мМ DTT
Буфер R 50 мМ KPi pH 7,0, 2 мМ DTT, 10 мМ L-аргинина, x мМ глюкозы

Таблица 1: Буферы, используемые в этом протоколе.

2. Протеолипосомы: восстановление очищенных мембранных белков в предварительно сформированные липидные везикулы

  1. День 1
    1. Приготовление предварительно сформированных липидных везикул
      1. Выбирайте липидный состав (например, синтетические фосфолипиды, полярные липиды E. coli ) исходя из требований мембранных белков.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь DOPE, DOPG и DOPC (25:25:50 моль%) является хорошей отправной точкой, но для некоторых белков могут потребоваться стеролы или кардиолипин; Для белков плазматических мембран дрожжей мы включаем пальмитоил-олеоиллипиды вместо диолеола30. Смесь Dope, DOPG и DOPC (25:25:50 мол%) достаточна для восстановления ArcD и GlpT.
      2. Смешайте желаемые липиды (растворенные в CHCl3) и выпарите CHCl3 во вращающемся испарителе до образования липидной пленки. Промойте липиды, добавив диэтиловый эфир в объеме, равном CHCl3. Выпарить диэтиловый эфир и получить сухую липидную пленку.
      3. Ресуспендируйте липидную пленку до 20 мг/мл общего количества липидов в водных средах (буфер А). Начните с половины общего объема и осторожно встряхните; Затем осторожно переложите липиды в чистую пробирку или флакон подходящего размера. Добавьте в колбу свежий буфер А и повторите процедуру, чтобы растворить оставшиеся липиды и перенести их в новый сосуд. Добавьте дополнительный буфер А для достижения конечной концентрации 20 мг/мл.
      4. Произведите ультразвуковую обработку ресуспендированных липидов с помощью зондового ультразвукового аппарата. Используйте следующие параметры для наконечника ультразвуковой аппарата диаметром 6 мм: интенсивность 4 мкм, амплитуда 70%, 5 с вкл, 45 с выкл., 16 циклов. Погрузите липиды в ванну с ледяной водой, содержащую EtOH, чтобы избежать перегрева при ультразвуковой обработке.
      5. Мгновенно заморозьте образец ультразвуком (объем 40 мл в центрифужной пробирке объемом 50 мл) в жидком азоте и разморозьте образец на водяной бане при комнатной температуре. Повторите один раз; затем аликвотируйте липосомы в желаемых объемах (например, 1 мл или 20 мг общих липидов в пластиковой пробирке объемом 1,5 мл).
        ТОЧКА ОСТАНОВКИ: На этом этапе процедура может быть остановлена. Заморозьте каждую аликвоту еще раз (третий цикл) и храните в жидком азоте до нескольких месяцев. Позаботьтесь о том, чтобы дважды проколоть крышки тюбиков иглой, чтобы избежать взрыва трубки при быстром закипании жидкого азота.
  2. День 2
    1. Восстановление очищенных мембранных белков в предварительно сформированные липосомы
      1. Разморозьте одну аликвоту липосом (20 мг общего количества липидов) на водяной бане при комнатной температуре. Тем временем подготовьте экструдер, применив фильтр по выбору (например, поликарбонат, диаметр пор 400 нм); предварительно уравновесить экструдер буфером А; и загрузите размороженные липосомы («молочный раствор») в экструдер и пропустите их 13 раз через фильтр. Соберите выдавленные липосомы (теперь крупные униламеллярные везикулы; «непрозрачный раствор») в стеклянном или пластиковом сосуде соответствующего размера (например, 15 мл). Разбавьте липосомы до 4 мг/мл с помощью буфера А с добавлением 2 мМ DTT.
      2. Перенесите 1 мл липосом 4 мг/мл в прозрачную кювету объемом 1 мл. В спектрофотометре измерьте начальную оптическую плотность на длине волны 540 нм. Вылейте отмеренный образец обратно и добавьте в липосомы 50 мкл 10% v/v Triton X-100.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Объем титрования 50 мкл 10% Triton-X100 подходит для 20 мг липидов в объеме 5 мл; добавление Triton X-100 позволит разбавить липиды на ~5%. Регулируйте объем титрования при работе с разным количеством липосом. Для получения стабильных сигналов оптической плотности титруйте липосомы с помощью Triton X-100 при комнатной температуре.
      3. Повторите шаг 2.2.1.2 и обратите внимание на достижение максимальной оптической плотности (Rsat). Продолжайте титрование до тех пор, пока не будет достигнута оптическая плотность примерно 60% Rsat (Рисунок 4). Вылейте дестабилизированные моющим средством пузырьки обратно в стеклянную/пластиковую пробирку (конечный объем теперь составляет примерно 5,2 мл), перенесите образец в лед и дайте ему остыть.
      4. Добавьте очищенный мембранный белок(ы) к дестабилизированным липосомам для достижения желаемого соотношения липидов и белка (w/w). Используйте соотношение от 400:1 до 100:1 w/w; поскольку и ArcD, и GlpT имеют молекулярную массу ~55 кДа, соотношение липидов к белку 400:1 w/w соответствует ~30 000 липидов на белок и ~ 50 молекул ArcD и GlpT на везикулы диаметром 400 нм.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем 400:1 вес. , что соответствует 50 мкг каждого белка на 20 мг липидов.
      5. Измельчите образцы при температуре 4 °C в течение 15 минут, чтобы мембранные белки могли внедриться в дестабилизированную липосомальную мембрану.
      6. Чтобы удалить моющее средство, добавьте 200 мг сухих гранул полистирола, приготовленных в соответствии с инструкциями производителя. Нутате при температуре 4 °C еще 15 минут.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество 200 мг сухих гранул подходит для 20 мг липидов, но его следует корректировать при использовании другого размера образца.
      7. Повторите шаг 2.2.1.6 2 раза, всего три добавления гранул полистирола. Затем инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C с легким накручиванием.
  3. День 3
    1. Повторите шаг 2.2.1.6; однако на этот раз нутате при 4 °C в течение 1 часа.
    2. Закрепите на льду пустую колонну гравитационного потока (емкостью 10 мл) над пустой ультрацентрифугирующей трубкой объемом 6,5 мл. Высыпьте образец в колонку и соберите протеолипосомы в ультрацентрифугирующую пробирку (шарики сохраняются в колонке).
    3. Промойте шарики 0,5 мл буфера А с добавлением 2 мМ DTT и соберите фильтрат в ультрацентрифугирующую пробирку.
    4. Концентрируйте протеолипосомы с помощью ультрацентрифугирования (337 000 × г, 30 мин, 4 °С). Ресуспендируйте протеолипосомы в общем объеме 200 мкл (100 мг липид/мл) в буфере А с добавлением 2 мМ DTT; сухой объем везикул после центрифугирования составляет от ~40 до 120 мкл27. Разделить на аликвоты желаемого размера (например, три аликвоты по 6,66 мг общего липидов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер аликвоты является произвольным, но будет влиять на размер гранул на последующих этапах (см. шаг 3.2.3.1). ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Здесь процедуру можно остановить. Заморозьте каждую аликвоту и храните в жидком азоте до нескольких недель. Будьте осторожны, дважды проткните крышки пробирок иглой, чтобы избежать взрыва пробирки при быстром закипании жидкого азота.

Figure 4
Рисунок 4: Титрование предварительно сформированных липосом с помощью Triton X-100. Липосомы в концентрации 5 мг липидов/мл экструдируют через поликарбонатный фильтр (400 нм) с температурой 50 мМ KPi (pH 7,0), а затем титруют с помощью Triton X-100 (шаг протокола 2.2.1.2). Помутнение везикул измеряется на уровне А540. Стрелкой указана концентрация Triton X-100, при которой везикулы достаточно дестабилизированы для спонтанного встраивания мембранных белков, как описано впункте 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Инкапсуляция метаболической сети для рециркуляции АТФ и синтеза глицерина 3-P в субмикронных везикулах

  1. День 1
    1. Смешивание компонентов
      1. Для стандартной инкапсуляции используйте 66,6 мкл протеолипосом в конечном объеме 200 мкл (33,33 мг/мл общего количества липидов). Рассчитайте объем каждого компонента (фермента, кофактора), необходимый для достижения желаемой концентрации, добавьте эти компоненты в протеолипосомы и отрегулируйте объем до 200 мкл с помощью буфера А (табл. 2).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка может быть скорректирована в зависимости от экспериментальной установки. Тем не менее, следует следить за тем, чтобы в среднем на везикулу присутствовало несколько копий (>10) каждого фермента, чтобы избежать нежелательных стохастических эффектов. Концентрации > 1 мкМ, как правило, безопасны; 1 мкМ в везикуле диаметром 400 нм соответствует примерно 20 копиям (рис. 3).
      2. Поместите пипетку в буфер А в пустую пробирку объемом 1,5 мл и добавьте DTT, Na-ADP, MgCl2, L-орнитин (и пиранин, если это необходимо для внутренних измерений pH). Далее добавьте ферменты и аккуратно перемешайте. Добавьте раствор поверх предварительно сформированных протеолипосом, и кратковременно сделайте вихрь на низкой скорости.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Важно добавлять Na-ADP до MgCl2 , чтобы избежать нежелательного образования осадков фосфата магния. Вортексирование необходимо для правильного перемешивания вязкого раствора; Однако сведите к минимуму продолжительность и скорость, чтобы избежать механического повреждения белков. PercevalHR и пиранин не могут быть совместно инкапсулированы, потому что их спектры перекрываются.
    2. Определение внутренней осмоляльности
      1. Приготовьте раствор объемом 50 мкл, как описано в шаге 3.1.1.1, но без протеолипосом, и измерьте осмоляльность с помощью осмометра с температурой замерзания.
      2. Подготовьте калибровочную кривую с использованием буфера (50 мМ KPi pH 7,0) и различных концентраций соли (например, NaCl или NaCl) или сахара. Определить концентрацию осмолита, соответствующую внутренней осмоляльности (буфер N).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Мембранопроницаемые компоненты (например, глицерин) не могут использоваться для выравнивания внутренней осмоляльности. Для белков, растворенных в глицеринсодержащем буфере (например, буфере Е), следует использовать тот же буфер без глицерина. Осмолит, выбранный для приготовления изоосмотического наружного буфера, должен быть мембранонепроницаемым и не мешать метаболической сети.
    3. Замораживание-размораживание
      1. Мгновенно заморозьте (в жидком азоте) протеолипосомы вместе с растворимыми компонентами и разморозьте в водяной ледяной бане при температуре около 10 °C.
      2. Повторите шаг 3.1.3.1 в общей сложности 5 раз.
        ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Здесь процедуру можно остановить. Пропустите последний этап размораживания и храните замороженный образец в жидком азоте в течение 1-3 дней. Будьте осторожны, чтобы проткнуть крышки пробирок 2 раза иглой, чтобы избежать взрыва трубки при быстром закипании жидкого азота. Хранение в жидком азоте предпочтительно при температуре выше -80 °C для минимизации окисления липидов.
  2. День 2
    1. Экструзия
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы экструзии выполняются при комнатной температуре, так как в противном случае газонепроницаемые шприцы будут протекать.
      1. Подготовьте экструдер, применив фильтр по выбору (например, поликарбонат, диаметр пор 400 нм). Промойте экструдер раствором, содержащим тот же буфер и метаболиты, которые используются для инкапсуляции везикул (например, буфер O плюс 0,1 мМ пиранин).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте специальный экструдер для загрузки протеолипосомов пиранином, поскольку краситель прилипает к поверхности экструдера и может вызвать загрязнение в последующих образцах.
      2. Загрузите инкапсуляционную смесь в экструдер, и пропустите ее через фильтр 13 раз. Соберите экструдированный раствор в пробирку объемом 1,5 мл.
    2. Эксклюзионная хроматография (по желанию)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется для удаления внешних молекул, таких как красители, такие как пиранин, с помощью эксклюзионной хроматографии. Если в системе отсутствуют красители, а другие компоненты не оказывают помех при низких концентрациях (обратите внимание, что везикулы впоследствии также промываются ультрацентрифугированием), то шаг 3.2.2. можно пропустить.
      1. Регидратируйте смолу Sephadex G-75 и вылейте ее в стеклянную колонку (длиной 22 см, шириной 1,5 см). Уравновесьте смолу с избытком внешнего буфера (например, буфера N).
      2. Загрузите экструдированные протеолипосомы, начиная с шага 3.2.1.2, в колонку для предварительно уравновешенной хроматографии с исключением размера и примените гравитационный поток внешнего буфера. Выбросьте объем пустот (примерно 7 мл); затем соберите десять аликвот по 1 мл. Визуализируйте аликвоты, содержащие протеолипосомы, при коротком воздействии ультрафиолетовой лампы. Объедините фракции, содержащие большую часть протеолипосом (2-4 мл).
    3. Стирка и ресуспензия
      1. Промойте экструдированные протеолипосомы ультрацентрифугированием. Наполните ультрацентрифужную пробирку объемом 6,5 мл 5,8 мл буфера N и нанесите сверху экструдированный образец. Если проводилась эксклюзионная хроматография, заполните пробирку объединенными образцами элюирования (2-4 мл) и добавьте буфер N до конечного объема 6 мл.
      2. Центрифуга при 337 000 × г, 30 мин, 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и тщательно высушите ультрацентрифужную пробирку беспыльной салфеткой, стараясь при этом не прикасаться к грануле. Ресуспендируйте гранулу в небольшом объеме буфера N (200 μл). Когда пеллета полностью ресуспендируется, заполните пробирку объемом до 6 мл буфером N.
        ПРИМЕЧАНИЕ: повторная суспензия гранул займет время и должна выполняться осторожно.
      3. Повторите шаги 3.2.3.1-3.2.3.2 2 раза, в общей сложности три промывки, если не проводится эксклюзионная хроматография (в этом случае достаточно одной ступени центрифугирования). В конечном итоге, ресуспендируйте гранулу до желаемой концентрации (например, 5,55 мг/мл общего липида) путем добавления соответствующего объема буферного N.
        ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Протеолипосомы можно использовать немедленно или хранить при температуре 4 °C в течение не менее 48 часов. Размер ультрацентрифужных пробирок следует выбирать исходя из размера образца. Для гранулы с 6,66 мг общего липида подходит пробирка объемом 6,5 мл. Промывка 200 мкл протеолипосом (всего 33,33 мг липидов/мл; объем сухих гранул ~40 мкл)28 для 3 x 6 мл буфера разбавляет внешние компоненты в 100 раз для каждого этапа промывки. Если используются трубки разных размеров, желательно соответствующим образом отрегулировать количество стирок.
  3. День 3
    1. Определение синтеза АТФ методом флуоресценции
      1. Смешайте компоненты реакции до конечного объема 120 мкл (таблица 3) в кювете из черного кварца с окном 3 х 5 мм и минимальным внутренним объемом 100 мкл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ионофоры могут быть добавлены для рассеивания электрохимических ионных градиентов. Смесь валиномицина и нигерицина (по 1 мкМ) эффективно рассеивает любые протонные и калиевые градиенты.
      2. Предварительно нагрейте образец во флуориметре, настроенном на 30 °С, и получите спектры возбуждения PercevalHR (возбуждение 400-520 нм, полоса пропускания 5 нм; излучение 550 нм, полоса пропускания 5 нм). После того как сигнал зонда станет постоянным, запустите метаболическую сеть путем добавления избытка L-аргинина (5-10 мМ) и глицерина (400 мкМ), когда рециркуляция АТФ связана с синтезом глицерина-3-фосфата. Следите за реакцией с течением времени.
    2. Анализ данных
      1. Построите график соотношения F500/F430 в зависимости от времени, которое является качественным показателем отношения ATP/ADP. Для более количественной оценки образования АТФ постройте калибровочную кривую в протеолипосомах или используйте дополнительный подход (например, количественное определение АТФ с помощью хемилюминесценции28).
Компонент Конечная концентрация
Буфер А 50 мМ KPi pH 7,0
ДТТ 2 мМ
Na-ADP 10 мМ
MgCl2 10 мМ
L-орнитин 0,5 мМ
Флуоресцентный зонд (PercevalHR или пиранин) 5,8 мкМ или 0,1 мМ соответственно
ArcA (аргининдеиминаза) 1 мкМ
ArcB (орнитинкарбамоилтрансфераза) 2 мкМ
ArcC1 (Карбаматкиназа) 5 мкМ
GlpK (глицеринкиназа) 1,6 мкМ
Протеолипосомы 33,33 мг/мл общих липидов

Таблица 2: Компоненты инкапсуляции. Компоненты перечислены в порядке добавления. Растворимые белки находятся в буфере Е; все остальные компоненты (кроме MgCl2, в деионизированной воде) находятся в буфере А.

Компонент Конечная концентрация
Буфер K 50 мМ KPi pH 7,0, 58 мМ NaCl, 2 мМ DTT, pH 7,0
Протеолипосомы (5,55 мг/мл липидов) 2,7 мг/мл липидов
Ионофоры (валиномицин, нигерицин) 1 мкМ каждый

Таблица 3: Условия эксперимента. Компоненты перечислены в порядке добавления. Протеолипосомы находятся в буфере N, ионофоры — в ДМСО или EtOH.

4. Масштабирование метаболической сети для везикул микрометрового размера

  1. День 1
    1. Микрофлюидная подготовка чипов
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используется микрофлюидное устройство, разработанное Robinson et al.34. Доступны и другие конструкции микрофлюидных чипов 35,36,37 и могут быть легко реализованы в этом протоколе.
      1. Отрежьте наконечник пипетки объемом 200 мкл на одну треть от дна и вставьте нижнюю часть наконечника в готовое микрофлюидное улавливающее устройство.
      2. Во входной резервуар чипа добавьте 400 мкл раствора β-казеина (2 мг/мл; см. шаг 1.5), стараясь не допустить попадания воздуха на этом этапе. Поместите пластинчатое ведро на 96 лунок и добавьте лабораторную салфетку в настольную центрифугу с конической трубкой. Поместите чип поверх ткани и центрифугируйте в течение 6 минут при давлении 900 × g , чтобы обеспечить пассивацию микрофлюидного чипа. После этапа центрифугирования уровень жидкости должен быть равным на входном резервуаре и выходном конце микрофлюидного чипа; Проверьте на герметичность чипа. Инкубируйте раствор β-казеина в микрофлюидном чипе не менее 30 минут.
      3. Удалите большую часть пассивирующего раствора без подачи воздуха и добавьте 400 мкл промывочного буфера (буфер P). Поместите чип на 96-луночную пластину и центрифугируйте при давлении 900 × г в течение 6 минут. Оставьте чип в моющем растворе до использования (максимум на 4 часа).
  2. Гелевый препарат для изготовления протео-ГУВ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующее описание взято и адаптировано из25,38.
    1. Растворить 0,5% (масса/масса) низкожелирующей температуры (LGT) агароза в деионизированной воде путем нагревания раствора в микроволновой печи; Убедитесь, что агароза полностью растворилась и не допускайте закипания раствора. Держите агарозу при температуре 50 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворенная агароза может храниться при комнатной температуре в течение нескольких недель. Чтобы повторно использовать агарозу, просто растопите гель с помощью микроволновой печи.
    2. Возьмите два объективных слайда и нарисуйте контур прокладки на слайдах. Сделайте слайды гидрофильными с помощью плазменной очистки с использованием плазмы с высоким содержанием кислорода в течение 1 минуты.
    3. Добавьте агарозу LGT на предметное стекло до полного покрытия агарозой (~500 μл); Затем наклоните предметное стекло под углом 90° и слейте излишки агарозы на салфетку. Оставьте предметные стекла на 30 минут при температуре 50 °C.
    4. Возьмите протеолипосомы, хранящиеся в жидком азоте (раздел 3) и разморозьте на льду. Разбавьте везикулы до 5 мг/мл липидов с помощью буфера Q.
      Протеолипосомы, приготовленные в разделе 3, не содержат растворимых белков и могут быть приготовлены заблаговременно при хранении в жидком азоте. При работе с протеоГУВ обязательно всегда фильтруйте рабочие растворы, чтобы предотвратить засорение микрофлюидного устройства.
    5. Протеолипосомы обрабатываются ультразвуком с помощью ручного зондового ультразвукового аппарата с зондом диаметром 1 мм. Ультразвуковая обработка в течение 10 циклов по 0,5 с включено и 0,5 с выключено при амплитуде 70%. Держите везикулы, далее именуемые proteoSUV, на льду в течение 30 секунд и повторите процесс ультразвуковой обработки 5 раз.
    6. Наполните шприц объемом 100 мкл (в портативном дозаторе LCP) суспензией proteo-SUV. Нанести 0,5 мкл капель proteo-SUV на ранее приготовленный агарозный гель; Будьте осторожны, чтобы не потревожить слой агарозы и держаться на достаточном расстоянии, чтобы капли не срослись.
      ПРИМЕЧАНИЕ Использование ручного диспенсера LCP позволяет воспроизводимо осаждение капель, но также можно использовать альтернативные системы пипетирования. Пятнистость стеклянным капилляром менее подходит, поскольку она нарушает работу высушенного агарозного геля.
    7. Высушите капли внедорожника за ~10 минут, используя поток азота вместо сжатого воздуха, чтобы снизить возможность окисления липидов.
    8. Приготовьте 1 мл концентрированного в 1,25 раза концентрированного O (Таблица 4) в буфере A и пропустите через фильтр с содержанием ацетата целлюлозы 0,2 мкм. Возьмите 800 мкл концентрированного раствора в 1,25x и добавьте растворимые ферменты и зонды в концентрацию, указанную в таблице 4. Используйте фильтрованную деионизированную воду, чтобы сделать итоговый объем 1 мл.
    9. Приготовьте 100 мкл раствора для набухания, содержащего все компоненты таблицы 4, за исключением белков и глицерина. Измерьте осмоляльность набухающего раствора с помощью 3-точечного калиброванного осмометра с температурой замерзания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 100 мкл раствора для набухания без белка и глицерина, чтобы точно определить осмоляльность этого раствора. Глицерин, присутствующий в белковом растворе, влияет на осмоляльность, но в ГУВ глицерин быстро диффундирует по мембране и приводит только к переходным осмотическим различиям.
    10. Соберите камеру набухания GUV, сделав сэндвич из двух объективных стекол, содержащих гелевые и высушенные внедорожники, с тефлоновой прокладкой толщиной 1,5 или 3,0 мм между ними. Затем добавьте раствор для набухания в камеру через небольшое отверстие сбоку с помощью шприца и иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем набухающего раствора можно регулировать, изменяя расстояние распорок от 1,5 до 3,0 мм.
  3. Набухание везикул и сбор GUV
    1. Дайте пузырькам набухнуть, поставив камеру при температуре 22 °C не менее чем на 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Набухание везикул может сопровождаться с помощью световой микроскопии (например, настольного фазовоконтрастного микроскопа или широкопольного флуоресцентного микроскопа), если белки или липиды флуоресцентно помечены.
    2. Соберите GUV из геля, применяя мягкое физическое перемешивание, постукивая камерой по твердой поверхности (например, лабораторному столу); Выньте одну треть объема и используйте образовавшийся пузырь воздуха, чтобы мягко вызвать движение оставшейся жидкости, тем самым отделив GUV от геля.
    3. Пока GUV набухают, приготовьте буфер P и согласуйте осмоляльность с раствором для набухания, регулируя концентрацию глюкозы. Отфильтруйте буфер через шприцевой фильтр 0,2 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, раствор для мытья и субстрата следует хранить в пределах ± 5 момоля/кг. Любой раствор, проходящий через чип, должен быть очень чистым, так как загрязнения могут засорить каналы. Каждый раз вносите свежие буферы или храните подготовленные буферы при температуре -20 °C и фильтруйте перед использованием.
  4. Захват GUV для экспериментов с микроскопией
    1. Установите пассивированный микрофлюидный чип на предметный столик микроскопа. Проверьте наличие возможных дефектов (например, утечки, застрявший воздух, забитые каналы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверка чипа может быть выполнена задолго до его использования, чтобы при необходимости можно было подготовить новую стружку.
    2. Подсоедините трубку с помощью изогнутой иглы к выходному отверстию резервуара, а другой конец подсоедините к шприцу объемом 1 мл. Установите шприц на насос и установите максимальную скорость потока на 10 мкл/мин.
    3. Извлеките промывочный буфер из резервуара (шаг 4.1.1.3) и замените его на свежую среду (буфер P). Запустите поток буфера через чип путем вливания через шприц со скоростью 1-10 мкл/мин. Умывайтесь не менее чем 80 μл осмотично сбалансированного буфера для стирки (буфер P).
    4. Удалите излишки промывочного буфера из резервуара и добавьте в резервуар (proteo)GUVs. Отрегулируйте расход в пределах 0,1-1 μл/мин, чтобы позволить GUV проходить через чип. Контролируйте чип с течением времени, пока в нем не будет захвачено достаточное количество GUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Везикулы с относительно большими количествами (>20 мол.%) заряженных липидов, таких как фосфатидилглицерин (ПГ), фосфатидилсерин (ПС) или фосфатидная кислота (ПА), или небислоеобразующих липидов, таких как фосфатидилэтаноламин (ПЭ), вводятся с более низкой скоростью потока через чип для предотвращения разрыва. Везикулы, состоящие из чистого фосфатидилхолина (ПК), как правило, более стабильны.
    5. Удалите избыток раствора GUV и добавьте промывочный буфер P, используя постоянный расход 0,1-1 мкл/мин, для замены внешней среды и промойте захваченные GUV в течение не менее 1 часа для удаления неинкапсулированных соединений и снижения фоновой флуоресценции при инкапсуляции флуорофора. Контролировать фоновую флуоресценцию с течением времени; Если фоновая флуоресценция не снижается, чип может быть заблокирован.
    6. Локализуйте ловушки с достаточным количеством везикул и сохраняйте их позиции. Примените настройки на микроскопе (например, интенсивность лазера, усиление, длина волны) и начните эксперимент с временными рядами.
    7. Добавьте в резервуар осмотически сбалансированный раствор субстрата (буфер R) и начните работать со скоростью 0,5 мкл/мин.

Компоненты буфера L
Компонент 1,25 x концентрация Рабочая концентрация
Буфер А 62,5 мМ KPi pH 7,0 50 мМ KPi pH 7,0
Сахароза 125 мМ 100 мМ
ДТТ 2,5 мМ 2 мМ
Na-ADP 12,5 мМ 10 мМ
MgCl2 12,5 мМ 10 мМ
L-орнитин 0,625 мМ 0,5 мМ
Компоненты инкапсуляции
Пиранин или ПерсевальHR 1 мМ или 20 μМ
ArcA (аргининдеиминаза) 1 мкМ
ArcB (орнитинкарбамоилтрансфераза) 2 мкМ
ArcC1 (Карбаматкиназа) 5 мкМ

Таблица 4: Буфер O и компоненты инкапсуляции. Компоненты перечислены в порядке добавления. Все компоненты (за исключением MgCl2 в деионизированной воде) находятся в буфере А. Компоненты инкапсуляции перечислены в порядке добавления. Все водорастворимые белки находятся в буфере Е.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Восстановление солюбилизированных мембранных белков в липосомах требует дестабилизации предварительно сформированных везикул. Добавление небольших количеств Triton X-100 первоначально приводит к увеличению поглощения на длине волны 540 нм (A540) из-за увеличения рассеяния света за счет набухания везикул (Рисунок 4). Максимальным значением A540 является точка, в которой липосомы насыщаются детергентом (Rsat), после чего любое дальнейшее добавление Triton X-100 приведет к частичной солюбилизации везикул. При Rзоле липосомы полностью растворяются (рис. 4). Для восстановления мембранных белков мы обычно используем везикулы, дестабилизированные до 60% за пределами Rsat (обозначены стрелкой).

Восстановленный мембранный белок ArcD используется для транспортировки L-аргинина в везикулы и L-орнитина из них и используется вместе с инкапсулированными ферментами ArcA, ArcB и ArcC для рециркуляции АТФ из АДФ и неорганического фосфата. GlpT является глицерин-3-фосфат/фосфатным антипортером, который вместе с GlpK необходим для синтеза (и выведения) глицерина-3-фосфата из глицерина плюс АТФ, образующегося в результате распада L-аргинина. Добавление 5 мМ L-аргинина при t = 0 к протеолипосомам приводит к резкому увеличению соотношения флуоресценции PercevalHR при возбуждении 500 и 430 нм39, что отражает соотношение АТФ/АДФ внутри везикул (рис. 5). При добавлении глицерина АТФ используется для синтеза глицерина-3-фосфата, что приводит к снижению соотношения АТФ/АДФ28. Распад L-аргинина также приводит к изменениям pH, которые можно количественно оценить с помощью пиранина или pHluorin27.

Figure 5
Рисунок 5: Рециркуляция АТФ путем распада L-аргинина. LUV в концентрации 2,7 мг липид/мл помещают в кювету и регистрируют соотношение флуоресценции при 500 нм и 430 нм. 5 мМ L-аргинина добавляют при t = 0. Отношение F500/F430 является мерой отношения АТФ/АДФ внутри везикул. Сокращение: LUV = крупно-униламеллярные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

LUV, продуцирующие АТФ, также могут быть использованы для формирования GUV. Регидратация высушенных протео-LUV на агарозном геле LGT приводит к образованию везикул микрометрового размера (Рисунок 6). Образование протео-ГУВ в высушенных пятнах LUV в значительной степени зависит от локальной концентрации липидов и степени обезвоживания. В некоторых областях есть большие участки GUV, в то время как в других местах в той же капле GUV может не образоваться или образуется несколько. Образование GUV с помощью набухания с помощью ЛГТ приводит к диапазону размеров GUV, обычно от нескольких микрометров до более чем 50 мкм.

Figure 6
Рисунок 6: ДВС-изображения proteoGUV, образованных гелевым набуханием. Масштабная линейка = 25 мкм. Сокращения: DIC = дифференциальный интерференционный контраст; GUVs = гигантско-униламмеллярные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

GUV собирают и захватывают в микрофлюидном устройстве на основе β-казеина на основе PDMS (Рисунок 7). Устройство сконструировано таким образом, что в рамках одного эксперимента может быть захвачено и проанализировано множество везикул, а устройство используется для управления внешней средой (скоростью потока, составом буфера и т. д.) 34. Даже при низком выходе протео-GUV постоянный поток GUV через микрофлюидный чип позволяет собрать множество везикул. После того, как достаточное количество GUV захвачено, система промывается осмотически сбалансированным буфером для удаления внешних компонентов, таких как растворимые белки, малые молекулы и флуоресцентные зонды. Затем промывочный буфер заменяют субстратным раствором равной осмоляльности, содержащим 50 мМ KPi (pH 7,0), различные количества глюкозы (для регулировки осмоляльности) и субстраты, такие как 10 мМ L-аргинина. Эксперимент с временными рядами проводится на нескольких ловушках микрофлюидного чипа и каждые 90 с делаются изображения (возбуждение 405 нм и 488 нм при использовании PercevalHR). Кроме того, в каждой временной точке делается светлопольное изображение. Отношение интенсивностей излучения после возбуждения при 488 и 405 нм является мерой отношения АДФ/АТФ в везикулах.

Figure 7
Рисунок 7: Захват везикул с помощью микрофлюидного чипа. (А) Захват везикул, сопровождающийся способностью контролировать внешнюю среду и скорость потока. (B) ProteoGUVs, захваченные в микрофлюидное устройство и возбуждаемые лазером с длиной волны 405 нм (зеленый) и лазером 488 (красный). Излучение для обоих каналов измеряется на длине волны >500 нм. Светлопольное изображение позволяет визуализировать везикулы без флуоресценции. Масштабная линейка = 25 мкм. Сокращение: GUVs = гигантско-униламеллярные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представляем протокол синтеза (мембранного) белка, содержащего липидные везикулы субмикронного размера (proteoLUVs), и превращения proteoLUV в гигантско-униламеллярные везикулы (proteoGUVs). Протокол должен быть применим для восстановления других мембранных белков 13,19,30,40 и инкапсуляции метаболических сетей, отличных от представленных здесь путей распада L-аргинина и синтеза глицерина-3-фосфата.

Восстановление мембранных белков в липосомах обычно приводит к случайной ориентации белков внутри липидной мембраны. Для ArcD и Glpt ориентация не имеет значения, потому что белки действуют двунаправленно, а растворенные вещества движутся в зависимости от знака общего электрохимического потенциала. Для белков, которые функционируют в одном направлении, половина молекул не будет доступна для активности, когда их ориентация равна 50/50.

Экструзия везикул через поликарбонатный фильтр сужает распределение по размерам, и везикулы становятся более однородными, чем меньше размер пор фильтров. Тем не менее, меньшие везикулы имеют меньший объем и, следовательно, очень малое количество белков (ферментов, мембранных белков) на везикулу. Чтобы свести к минимуму долю LUV, в которых отсутствует один или несколько компонентов, концентрацию белков можно регулировать, как показано на рисунке 3А, В, но при очень малых везикулах стохастические эффекты неизбежны.

Метод набухания с помощью геля основан на нанесении ультразвуковых везикул (SUV) на высушенную поверхность агарозы. В процессе сушки формируется градиент концентрации везикул, а концентрация липидов наиболее высока на периферии пятна. Это связано с явлением, известным как эффект кофейного пятна41,42. В результате, только небольшая область в пределах пятна содержит концентрацию липидов, подходящих для образования GUV. Круглые неравномерно концентрированные липидные пятна приводят к образованию больших неиспользуемых участков, которые недоступны для слияния везикул; следовательно, эффективность формирования GUV при таком подходе становится низкой. Для увеличения выхода GUV следует стремиться к равномерному осаждению липидов, что может быть достигнуто путем нанесения полимерного покрытия42 или использования эффекта кофейного пятна41.

Дополнительные примечания к протоколу:

Следует следить за тем, чтобы несколько мембранных белков (>10) восстанавливались в среднем на каждую везикулу, чтобы избежать стохастических эффектов. Таким образом, избегайте соотношения липидов и белков выше 400:1 по массе. Для большинства белков предполагается случайная ориентация.

В идеале, чтобы объем общих мембранных белков был как можно меньше и в любом случае не превышал 10-20% от объема липосом. Добавление больших объемов приведет к увеличению количества моющего средства, и большинство предварительно сформированных липосом могут лизироваться, что может оказать негативное влияние на эффективность восстановления.

Предварительная балансировка экструдера соответствующим раствором важна для предотвращения разбавления компонентов во время инкапсуляции. В идеале раствор предварительного уравновешивания должен также содержать растворимые ферменты, но включение ферментов может быть слишком дорогостоящим из-за относительно большого объема, необходимого для предварительного уравновешивания экструдера. Поэтому мы обычно опускаем эти компоненты и принимаем 5%-ное разведение ферментов.

Ионофоры следует добавлять в смеси, содержащие протеолипосомы, поскольку молекулы обладают высокой гидрофобностью и могут адсорбироваться на поверхностях, если везикулы отсутствуют. Следует следить за тем, чтобы объем добавляемого растворителя был низким (<1% от общего объема реакции). Контроль проводится для того, чтобы убедиться, что растворители не влияют на метаболические сети в везикулах. Концентрации ионофоров около 1 мкМ, как правило, безопасны для общих концентраций липидов ~3 мг/мл.

Следует позаботиться о том, чтобы капли тщательно высохли. Если капли недостаточно сухие, образование GUV менее эффективно, так как липиды образуют липидные агрегаты, а MLV могут образовываться при добавлении набухающего раствора.

Глюкоза используется для согласования осмолярности внешней и внутренней среды; последний содержит сахарозу вместо глюкозы для увеличения плотности везикул и тем самым облегчения оседания ГУВ. Кроме того, глюкоза во внешней среде усиливает фазовый контраст, делая везикулу более заметной.

Стохастические эффекты представляют собой гораздо меньшую проблему с GUV; Но здесь отношение поверхности к объему может стать неприемлемо низким, так что количество мембранных белков (например, транспортеров) становится предельным для внутренней метаболической сети. Метод, описанный в этом протоколе, не позволяет точно контролировать размер протеоГУВ, но большинство из них находятся в диапазоне размеров 5-50 мкм.

В заключение, представленная здесь работа представляет собой всесторонний обзор восстановления мембранных белков и инкапсуляции ферментов в липидных везикулах различных размеров. Мы демонстрируем построение функциональных везикул для синтеза АТФ и строительных блоков из простых предшественников, таких как аминокислоты и глицерин. Восстановление мембранных белков в GUV остается сложной задачей, но представленные здесь протоколы прокладывают путь к дальнейшему развитию исследований в области синтетической биологии «снизу вверх».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят Адитью Айер за клонирование гена pBAD-PercevalHR и Геа Шуурман-Уолтерс за помощь в производстве и очистке белка. Исследование финансировалось в рамках программы NWO Gravitation «Построение синтетической клетки» (BaSyC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Aldrich A9414-25g
Amicon cut-off filter Sigma Aldrich Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra 
BioBeads BioRad 152-3920
CHCl3 Macron Fine Chemicals MFCD00000826
D(+)-Glucose Formedium -
D(+)-Sucrose Formedium -
DDM Glycon D97002 -C
Diethyl Ether Biosolve 52805
DMSO Sigma-Aldrich 276855-100ml
DOPC Avanti 850375P-1g
DOPE Avanti 850725P-1g
DOPG Avanti 840475P-1g
DTT Formedium  DTT005
EtOH J.T.Baker Avantor MFCD00003568
Extruder Avestin Inc LF-1
Fluorimeter Jasco Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol BOOM 51171608
Gravity flow column Bio-Rad 732-1010
Hamilton syringe 100 µL Hamilton 7656-01
Hamilton syringe 1000 µL Hamilton 81320
Handheld LCP dispenser Art Robbins Instruments 620-411-00
Handheld Sonicator Hielscher Ultrasound Technology UP50H
HCl BOOM x76021889.1000
Imidazole Roth X998.4-250g
K2HPO4 Supelco 1.05099.1000
KCl BOOM 76028270.1
KH2PO4 Supelco 1.04873.1000
Kimwipe Kimtech Science 7552
Large Falcon tube centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810 R
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006-100G
Light microscope Leica DM LS2
L-Ornithine Roth T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670-1KG
Microfluidic chip Homemade  PDMS based DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP Sigma-Aldrich A2754-1G
NaCl Supelco 1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer Isogen Life Science ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH Supelco 1.06498.1000
Needles for GUVs Henke-Ject 14-14575 27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics Henke-Ject 14-15538 18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose Cytiva 17526802
Nigericin Sigma-Aldrich N7143-5MG
Nutator VWR 83007-210
Osmolality meter Gonotec Salmenkipp Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger
Polycarbonate filter Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104 0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 355647
Pyranine Acros Organics H1529-1G
Quartz cuvette (black) Hellma Analytics 108B-10-40
Sephadex G-75 resin  GE Healthcare 17-0050-01
Sonicator Sonics Sonics & Materials INC Sonics vibra cell
Syringe filter Sarstedt Filtropur S plus 0.2 0.2 µm
Syringe pump Harvard Apparatus A-42467
Tabletop centrifuge Eppendorf centrifuge 5418
Teflon spacer Homemade  Teflon based 45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris PanReac AppliChem A1086.1000
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-100 ml
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima Max-E
UV lamp Spectroline ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer Jasco V730 spectrophotometer
Valinomycin Sigma-Aldrich V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope Zeiss AxioObserver
β-Casein Sigma Aldrich C5890-500g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
  2. Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges. Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).
  3. Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. Industrial biomanufacturing: The future of chemical production. Science. 355 (6320), (2017).
  4. Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design. Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).
  5. Wang, A., et al. Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168 (2020).
  6. Kanter, G., et al. Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines. Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).
  7. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).
  8. Jain, K. K. Synthetic biology and personalized medicine. Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).
  9. Schwille, P., Frohn, B. P. Hidden protein functions and what they may teach us. Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).
  10. Sachsenmeier, P. Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology. Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).
  11. Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).
  12. Godoy-Hernandez, A., et al. Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions. ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).
  13. Sikkema, H. R., et al. Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Sci Adv. 6 (47), 7697 (2020).
  14. Foucaud, C., Poolman, B. Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport. J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).
  15. Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization. Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).
  16. Simidjiev, I., et al. Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro. Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).
  17. Harris, N. J., Booth, P. J. Folding and stability of membrane transport proteins in vitro. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).
  18. Jackson, M. L., Litman, B. J. Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure. Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).
  19. Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  20. Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).
  21. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  22. Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1 (2023).
  23. Lee, K. Y., et al. Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system. Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).
  24. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. Methods in Enzymology. , Elsevier. 161-176 (2009).
  25. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J. Vis. Exp. (95), e52281 (2015).
  26. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  27. Pols, T., et al. A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis. Nat Commun. 10 (1), 4239 (2019).
  28. Bailoni, E., Poolman, B. ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis. ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).
  29. Van Der Heide, T. On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine. EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).
  30. Van'T Klooster, J. S., et al. Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).
  31. Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations. Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).
  32. Weiss, M., et al. Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics. Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).
  33. Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown. FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).
  34. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  35. Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459 (2019).
  36. Elias, M., et al. Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette. Micro Nano Eng. 8, 100064 (2020).
  37. Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore. Biomicrofluidics. 7 (4), 044105 (2013).
  38. Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths. Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).
  39. Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4 (1), 2550 (2013).
  40. Setyawati, I., et al. In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters. eLife. 9, e64389 (2020).
  41. Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles. Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).
  42. Estes, D. J., Mayer, M. Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).

Tags

Неравновесные метаболические сети восстановление мембранных белков большие униламеллярные везикулы (LUV) гигантские униламеллярные везикулы (GUV) биореакторы флуоресцентные сенсоры ферментная инкапсуляция метаболитная инкапсуляция
Построение неравновесных метаболических сетей в нано- и микрометровых везикулах
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, … More

Coenradij, J., Bailoni, E., Poolman, B. Construction of Out-of-Equilibrium Metabolic Networks in Nano- and Micrometer-Sized Vesicles. J. Vis. Exp. (206), e66627, doi:10.3791/66627 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter