توليد وتحليل صور الأنسجة عالية المعلمات باستخدام قياس التدفق الخلوي
Summary
الموصوفة هنا هي طريقة يمكن استخدامها لتصوير خمسة أو أكثر من المعلمات الفلورية بواسطة المجهر المناعي. تم تحديد خط أنابيب تحليل لاستخراج الخلايا المفردة من هذه الصور وإجراء تحليل الخلية الواحدة من خلال استراتيجيات بوابات تشبه قياس التدفق الخلوي ، والتي يمكنها تحديد مجموعات فرعية من الخلايا في أقسام الأنسجة.
Abstract
إن استخدام علم الأنسجة للتحقيق في تنوع الخلايا المناعية في أقسام الأنسجة مثل تلك المشتقة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) محدود للغاية بسبب عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها في وقت واحد. تم تعريف معظم المجموعات الفرعية للخلايا المناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي باستخدام مجموعات معقدة من علامات البروتين ، وغالبا ما تتطلب أربعة معلمات أو أكثر لتحديدها بشكل قاطع ، وهو ما يتجاوز قدرات معظم المجاهر التقليدية. نظرا لأن قياس التدفق الخلوي يفصل الأنسجة ويفقد المعلومات المكانية ، فهناك حاجة إلى تقنيات يمكنها الاحتفاظ بالمعلومات المكانية أثناء استجواب أدوار أنواع الخلايا المعقدة. تتم معالجة هذه القضايا هنا من خلال إنشاء طريقة لتوسيع عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها عن طريق جمع إشارات الفلوروفورات المتداخلة طيفيا واستخدام عدم الخلط الطيفي لفصل إشارات كل فلوروفور على حدة. ثم تتم معالجة هذه الصور باستخدام خط أنابيب تحليل لالتقاط صور الأنسجة عالية المعلمات واستخراج خلايا مفردة من هذه الصور بحيث يمكن تحليل خصائص الفلورسنت الفريدة لكل خلية على مستوى خلية واحدة. باستخدام استراتيجيات البوابات الشبيهة بقياس التدفق الخلوي ، يمكن بعد ذلك تحديد ملامح الخلايا في مجموعات فرعية وتعيينها مرة أخرى على أقسام الأنسجة ليس فقط لتحديد وفرتها ، ولكن أيضا لتحديد كيفية تفاعلها مع بيئة الأنسجة. بشكل عام ، تم إثبات بساطة وإمكانية استخدام قياس التدفق الخلوي النسيجي لدراسة مجموعات المناعة المعقدة في أقسام الأنسجة.
Introduction
يمكن أن يساهم الالتهاب الناجم عن خلايا الجهاز المناعي والخلايا الدبقية في الاضطرابات المزمنة في الجهاز العصبي المركزي حيث يمكن لكل مجموعة تعزيز نشاط1،2،3 الأخرى. إن فهم كيفية تفاعل الجهاز المناعي مع هذه العناصر من الجهاز العصبي المركزي لتعزيز التهاب الجهاز العصبي المركزي هو حاليا موضوع رئيسي للاهتمام وقد تم تسهيله إلى حد كبير من خلال التقنيات عالية المعلمات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، اكتشفنا أن هناك اتصالا مكثفا يحدث بين الخلايا الدبقية والجهاز المناعي في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي4،5،6. إن فهم كيفية تأثير هذه التفاعلات على هذه الاضطرابات سيكون أمرا حاسما لتوضيح بيولوجيا هذه الأمراض.
تتمثل إحدى مشكلات تحليلات تسلسل الخلية الواحدة في أن هذه التقنيات تتطلب تعطيل الأنسجة للحصول على خلايا أو نوى مفردة ، مما يؤدي إلى فقدان كامل للمعلومات المكانية. إن معرفة مكان وجود الخلية في الأنسجة أمر بالغ الأهمية لفهم دور الخلية في تحفيز الالتهاب. على سبيل المثال ، يمكن للخلايا المناعية مثل الخلايا البائية التركيز في الجهاز العصبي المركزي أثناء الالتهاب العصبي. ومع ذلك ، نادرا ما تدخل حمة الجهاز العصبي المركزي وبدلا من ذلك تركز في حواجز الجهاز العصبيالمركزي 7. نظرا لتوطينها ، فمن غير المحتمل أن تساهم هذه الخلايا في التهاب الجهاز العصبي المركزي من خلال التفاعل جسديا مع الخلايا الدبقية في حمة الجهاز العصبي المركزي ، مما يشير إلى أن أي تفاعلات قد تكون مع الخلايا الدبقية ستحدث من خلال عوامل مفرزة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون لعلم الأمراض الذي يحدث في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي بنية 8,9 بحيث يمكن لتوطين الخلية في الأنسجة أن يحدد بشكل حاسم ما إذا كانت تساهم بنشاط في الاضطراب أو أنها متفرج. وبالتالي ، فإن استخدام التوجه المكاني لتقييم دور الخلية في علم الأمراض أمر ضروري.
عادة ما يتم إنجاز دراسة الخلايا في الأنسجة باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية أو الفحص المجهري المناعي. تكمن مشكلة هذه التقنيات في أنها عادة ما يمكنها فقط تصوير ما يصل إلى أربعة معلمات في وقت واحد. وهذا قيد رئيسي على هذه التقنيات، كما نعلم من تحليلات قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أن العديد من مجموعات الخلايا تتطلب معلمتين أو أكثر لتحديدها؛ أيضا ، يزداد عدد المعلمات المطلوبة عادة عند البحث عن مجموعات فرعية محددة من نوع الخلية10. وبالتالي ، من غير العملي استخدام تقنيات التصوير القياسية لدراسة كيفية تفاعل مجموعات فرعية من الخلايا داخل الأنسجة.
تم التغلب على هذه المشكلة جزئيا من خلال طرق أحدث عالية المعلمات يمكنها الاحتفاظ بالمعلومات المكانية ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي المكاني11 وتصوير قياس الكتلةالخلوية 12. في حين أن هذه التقنيات ذات قيمة ، إلا أنها تواجه العديد من المشكلات ، مثل عدم توفرها على نطاق واسع ، وتقليل البيانات ثلاثية الأبعاد إلى بعدين ، وتتطلب خبرة كبيرة للتنفيذ. تقنية أخرى تعرف باسم التلوين المتسلسل ، حيث يتم تلطيخ الأنسجة بمجموعة واحدة من الأجسام المضادة متبوعة بتعطيل المجموعة السابقة من الأجسام المضادة قبل تلطيخها بمجموعة أخرى من الأجسام المضادة ، يمكن أن تحقق أنسجة عالية المعلمات دون الحاجة إلى معدات أو خبرة متخصصة13،14،15. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التلوين المتسلسل كثيف العمالة ويتطلب قدرا كبيرا من وقت الفحص المجهري ، والذي قد يكون غير عملي للمختبرات التي لا تمتلك مجهرا شخصيا. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنيات يمكنها زيادة عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها في وقت واحد على المجاهر المتاحة على نطاق واسع وفي الوقت المناسب.
بمجرد الحصول على البيانات عالية المعلمات ، تنشأ مشكلة أخرى: من غير المرجح أن تقوم طرق تحليل الصور التقليدية بتحليل البيانات بنجاح. لا تكون تقنيات مثل العد اليدوي أو العتبة قابلة للتطبيق إلا إذا كان التحليل يتكون من معلمة واحدة أو إذا كانت العلامات المتعددة لها نفس التوطين حيث يتم حساب الإشارات المتداخلة فقط. هذا القيد يجعل التحليل التقليدي غير كاف للعمل مع مجموعات البيانات عالية المعلمات. تم تحقيق تحليل ناجح لمجموعات البيانات هذه من خلال تقسيم الخلايا المفردة من صور الأنسجة ثم إجراء استراتيجيات بوابات تشبه قياس التدفق الخلوي لتحديد أنواع الخلايا16,17. ومع ذلك ، هناك مشكلة أخرى تؤثر على هذه التحليلات وهي أنها تعمل فقط مع مجموعات البيانات حيث يتم فصل جميع الخلايا ذات الأهمية ماديا عن بعضها البعض ، لأن هذه التقنيات لا تستخدم طرقا يمكنها فصل الخلايا التي هي على اتصال جسدي بدقة. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طريقة أحدث يمكنها إجراء تحليلات خلية واحدة على أقسام الأنسجة حتى لو كانت الخلايا على اتصال جسدي.
في هذه المقالة ، تم وصف بروتوكول بسيط يسمى قياس التدفق الخلوي النسيجي الذي تم تقديمه سابقا18 والذي يوسع عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها في وقت واحد باستخدام المجاهر المتاحة على نطاق واسع. يعمل هذا البروتوكول عن طريق تلطيخ الأنسجة بأصباغ متداخلة طيفيا ثم استخدام التعويض الطيفي لإزالة النزيف من القنوات المتداخلة للحصول على بقع مفردة واضحة. لتسهيل تحليل صور الأنسجة عالية المعلمات ، يتم وصف خط أنابيب تحليل مفصل يستخرج الخلايا المفردة من أقسام الأنسجة لغرض فرز الخلايا إلى مجموعات متميزة باستخدام استراتيجيات بوابات تشبه قياس التدفق الخلوي. يعمل هذا البروتوكول في الأنسجة التي توجد فيها الخلايا بشكل منتشر وفي الأنسجة التي تضغط فيها الخلايا معا بشكل وثيق، مما يجعل هذه التقنية متعددة الاستخدامات لدراسة الأنسجة مثل الجهاز العصبي المركزي في كل من الاتزان الداخلي والالتهاب العصبي. وبالتالي ، فإن قياس التدفق الخلوي النسيجي هو تقنية مفيدة لدراسة التفاعلات بين أنواع الخلايا المعقدة التي تتطلب علامات خلايا متعددة لتحديد الخلايا مع الحفاظ على المعلومات المكانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم وصف استخدام قياس التدفق الخلوي النسيجي ، وهي تقنية تم التحقق من صحتها سابقا18. ثبت أنه عند تلطيخ أقسام الأنسجة بأصباغ متداخلة طيفيا ، يمكن إزالة هذا النزيف عبر القنوات باستخدام التعويض الطيفي ، مما يؤدي إلى حل عدد أكبر من معلمات الفلورسنت بوضوح أكثر مما هو ممكن عادة م?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر منصة الفحص المجهري المتقدمة لمعهد هوتشكيس للدماغ على البنية التحتية للتصوير والخبرة. تم دعم RWJ من خلال تمويل زمالة ما بعد الدكتوراه من برنامج جامعة كالجاري Eyes High ومن قبل جمعية التصلب المتعدد في كندا وزمالة Roche Canada التعليمية غير المقيدة. تلقت VWY دعم الراتب من برنامج كرسي الأبحاث الكندي من المستوى 1. تم دعم هذا العمل من خلال أموال التشغيل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية Grant 1049959 ، ومنحة جمعية التصلب المتعدد الكندية 3236 ، ووزارة الدفاع الأمريكية لبرنامج أبحاث التصلب المتعدد الموجه من الكونغرس. يتم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com. تم نشر الأرقام التي تم تكييفها في هذا المنشور في الأصل في مجلة علم المناعة. راجيف دبليو جاين وديفيد أ. إليوت و في وي يونغ. 2023. تحليل الخلية المفردة لصور الأنسجة عالية المعلمات باستخدام قياس التدفق الخلوي النسيجي. J. المناعي. 210: 2038-2049. حقوق النشر © [2023]. الرابطة الأمريكية لعلماء المناعة ، Inc.
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
Riferimenti
- Bar-Or, A., Li, R. Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances. Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
- Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology. Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).
- Absinta, M., et al. A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis. Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Schirmer, L., et al. Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis. Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).
- Jain, R. W., Yong, V. W. B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology. Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).
- Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
- Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. A practitioner’s view of spectral flow cytometry. Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).
- Ramaglia, V., et al. Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry. Elife. 8, (2019).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies. J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).
- Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry. J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. , (2023).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Berg, S., et al. ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Ruhlandt, D., et al. Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity. Commun Biol. 3 (1), 627 (2020).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. 79, 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68 (2020).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
