Generierung und Analyse von High-Parameter-Histologiebildern mit Histoflow-Zytometrie
Summary
Hier wird ein Verfahren beschrieben, mit dem fünf oder mehr Fluoreszenzparameter mittels Immunfluoreszenzmikroskopie abgebildet werden können. Es wird eine Analysepipeline für die Extraktion einzelner Zellen aus diesen Bildern und die Durchführung von Einzelzellanalysen durch durchflusszytometrie-ähnliche Gating-Strategien skizziert, mit der Zelluntergruppen in Gewebeschnitten identifiziert werden können.
Abstract
Die Verwendung der Histologie zur Untersuchung der Immunzelldiversität in Gewebeschnitten, wie sie aus dem Zentralnervensystem (ZNS) stammen, ist durch die Anzahl der Fluoreszenzparameter, die gleichzeitig abgebildet werden können, entscheidend begrenzt. Die meisten Untergruppen von Immunzellen wurden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung komplexer Kombinationen von Proteinmarkern definiert, die oft vier oder mehr Parameter zur endgültigen Identifizierung erfordern, was über die Möglichkeiten der meisten herkömmlichen Mikroskope hinausgeht. Da die Durchflusszytometrie Gewebe dissoziiert und räumliche Informationen verliert, besteht ein Bedarf an Techniken, die räumliche Informationen speichern und gleichzeitig die Rollen komplexer Zelltypen hinterfragen können. Diese Probleme werden hier angegangen, indem eine Methode zur Erweiterung der Anzahl der Fluoreszenzparameter entwickelt wird, die abgebildet werden können, indem die Signale von spektral überlappenden Fluorophoren gesammelt und die Signale jedes einzelnen Fluorophors durch spektrale Entmischung getrennt werden. Diese Bilder werden dann mit einer Analysepipeline verarbeitet, um histologische Bilder mit hohen Parametern aufzunehmen und einzelne Zellen aus diesen Bildern zu extrahieren, so dass die einzigartigen Fluoreszenzeigenschaften jeder Zelle auf Einzelzellebene analysiert werden können. Mit Hilfe von Durchflusszytometrie-ähnlichen Gating-Strategien können Zellen dann in Untergruppen profiliert und auf die Histologieschnitte zurückgeführt werden, um nicht nur ihre Häufigkeit zu quantifizieren, sondern auch festzustellen, wie sie mit der Gewebeumgebung interagieren. Insgesamt wird die Einfachheit und das Potenzial der Verwendung der Histoflow-Zytometrie zur Untersuchung komplexer Immunpopulationen in histologischen Abschnitten demonstriert.
Introduction
Entzündungen, die von Zellen des Immunsystems und Gliazellen ausgelöst werden, können zu chronischen Erkrankungen des ZNS beitragen, bei denen jede Population die Aktivität der anderen fördern kann 1,2,3. Zu verstehen, wie das Immunsystem mit diesen Elementen des ZNS interagiert, um eine ZNS-Entzündung zu fördern, ist derzeit ein wichtiges Thema von Interesse und wurde durch hochparametrische Techniken wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung erheblich erleichtert. Durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung haben wir entdeckt, dass bei mehreren ZNS-Erkrankungen eine umfangreiche Kommunikation zwischen Gliazellen und dem Immunsystem stattfindet 4,5,6. Zu verstehen, wie sich diese Wechselwirkungen auf diese Erkrankungen auswirken, wird entscheidend sein, um die Biologie dieser Krankheiten aufzuklären.
Ein Problem bei Einzelzellsequenzierungsanalysen besteht darin, dass bei diesen Techniken das Gewebe aufgebrochen werden muss, um einzelne Zellen oder Zellkerne zu erhalten, was zu einem vollständigen Verlust der räumlichen Information führt. Zu wissen, wo sich eine Zelle in einem Gewebe befindet, ist entscheidend, um die Rolle der Zelle bei der Entstehung von Entzündungen zu verstehen. Zum Beispiel können sich Immunzellen wie B-Zellen während einer Neuroinflammation im ZNS konzentrieren; sie dringen jedoch selten in das ZNS-Parenchym ein und konzentrieren sich stattdessen in den ZNS-Schranken7. Angesichts ihrer Lokalisation ist es unwahrscheinlich, dass diese Zellen zur ZNS-Entzündung beitragen, indem sie physisch mit Gliazellen im ZNS-Parenchym interagieren, was darauf hindeutet, dass Wechselwirkungen, die sie mit Gliazellen haben könnten, durch sezernierte Faktoren erfolgen würden. Darüber hinaus weist die bei ZNS-Erkrankungen auftretende Pathologie häufig eine Struktur 8,9 auf, so dass die Lokalisation einer Zelle im Gewebe entscheidend bestimmen könnte, ob sie aktiv zu der Störung beiträgt oder ein Zuschauer ist. Daher ist die Verwendung der räumlichen Orientierung zur Bewertung der Rolle einer Zelle in der Pathologie unerlässlich.
Die Untersuchung von Zellen im Gewebe wurde in der Regel mit Hilfe der Immunhistochemie oder der Immunfluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Ein Problem bei diesen Techniken besteht darin, dass sie in der Regel nur bis zu vier Parameter gleichzeitig abbilden können. Dies ist eine große Einschränkung dieser Techniken, da wir aus der Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalysen wissen, dass viele Zellpopulationen zwei oder mehr Parameter für ihre Identifizierung benötigen; Außerdem erhöht sich die Anzahl der erforderlichen Parameter in der Regel, wenn nach bestimmten Teilmengen einer Zelle vom Typ10 gesucht wird. Daher ist es unpraktisch, Standard-Bildgebungsverfahren zu verwenden, um zu untersuchen, wie Untergruppen von Zellen innerhalb eines Gewebes interagieren können.
Dieses Problem wurde teilweise durch neuere Methoden mit hohen Parametern überwunden, die räumliche Informationen speichern können, wie z. B. die räumliche RNA-Sequenzierung11 und die bildgebende Massenzytometrie12. Diese Techniken sind zwar wertvoll, haben aber mehrere Probleme, wie z. B. dass sie nicht überall verfügbar sind, dreidimensionale Daten in zwei Dimensionen reduzieren und viel Fachwissen für die Ausführung erfordern. Eine andere Technik, die als sequentielle Färbung bekannt ist, bei der Gewebe mit einem Satz Antikörper gefärbt werden, gefolgt von einer Inaktivierung des vorherigen Antikörpersatzes, bevor sie mit einem anderen Satz von Antikörpern gefärbt werden, kann eine Histologie mit hohen Parametern erreichen, ohne dass spezielle Geräte oder Fachwissen erforderlich sind 13,14,15. Die sequentielle Färbung kann jedoch äußerst arbeitsintensiv sein und erfordert eine große Menge an Mikroskopiezeit, was für Labore, die kein persönliches Mikroskop besitzen, unpraktisch sein kann. Daher besteht ein Bedarf an Techniken, die die Anzahl der Fluoreszenzparameter erweitern können, die gleichzeitig auf Mikroskopen abgebildet werden können, die weit verbreitet und zeitnah abgebildet werden können.
Sobald die Daten mit hohen Parametern erfasst wurden, stellt sich ein weiteres Problem: Es ist unwahrscheinlich, dass herkömmliche Bildanalysemethoden die Daten erfolgreich analysieren können. Techniken wie manuelles Zählen oder Schwellenwerte sind nur dann praktikabel, wenn die Analyse aus einem einzigen Parameter besteht oder wenn mehrere Marker die gleiche Lokalisation haben, bei der nur überlappende Signale gezählt werden. Diese Einschränkung macht die herkömmliche Analyse für die Arbeit mit Datasets mit hohen Parametern ungeeignet. Eine erfolgreiche Analyse dieser Datensätze wurde durch die Segmentierung einzelner Zellen aus histologischen Bildern und die anschließende Durchführung durchflusszytometrischer Gating-ähnlicher Gating-Strategien zur Identifizierung von Zelltypen erreicht16,17. Ein weiteres Problem, das diese Analysen betrifft, besteht jedoch darin, dass sie nur für Datensätze funktionieren, bei denen alle interessierenden Zellen physisch voneinander getrennt sind, da diese Techniken keine Methoden verwenden, die Zellen, die in physischem Kontakt stehen, genau trennen können. Daher ist eine neuere Methode erforderlich, die Einzelzellanalysen in histologischen Schnitten auch dann durchführen kann, wenn die Zellen in physischem Kontakt stehen.
In diesem Artikel wird ein einfaches Protokoll namens Histoflow-Zytometrie beschrieben, das zuvor eingeführt wurde18 und das die Anzahl der Fluoreszenzparameter erweitert, die gleichzeitig mit weit verbreiteten Mikroskopen abgebildet werden können. Bei diesem Protokoll werden Gewebe mit spektral überlappenden Farbstoffen gefärbt und dann mit spektraler Kompensation Durchscheinen aus überlappenden Kanälen entfernt, um klare Einzelfärbungen zu erhalten. Um die Analyse von hochparametrischen Histologiebildern zu erleichtern, wird eine detaillierte Analysepipeline beschrieben, die einzelne Zellen aus Gewebeschnitten extrahiert, um Zellen mit Hilfe von Durchflusszytometrie-ähnlichen Gating-Strategien in unterschiedliche Populationen zu sortieren. Dieses Protokoll funktioniert in Geweben, in denen Zellen diffus vorhanden sind, und in Geweben, in denen Zellen eng miteinander verdichtet sind, was diese Technik vielseitig für die Untersuchung von Geweben wie dem ZNS sowohl in der Homöostase als auch in der Neuroinflammation macht. Die Histoflow-Zytometrie ist daher eine nützliche Technik zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen komplexen Zelltypen, die mehrere Zellmarker benötigen, um Zellen zu definieren und gleichzeitig räumliche Informationen zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird der Einsatz der Histoflow-Zytometrie beschrieben, eine Technik, die bereits zuvor validiert wurde18. Es wird gezeigt, dass bei der Färbung von Gewebeschnitten mit spektral überlappenden Farbstoffen dieses Durchscheinen über Kanäle mittels spektraler Kompensation entfernt werden kann, was dazu führt, dass eine größere Anzahl von Fluoreszenzparametern eindeutig aufgelöst wird, als dies normalerweise mit herkömmlichen Methoden möglich wäre. Da Histologiebilder mit hohen Parameter…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Hotchkiss Brain Institute Advanced Microscopy Platform für die Bildgebungsinfrastruktur und -expertise. RWJ wurde durch ein Postdoktorandenstipendium des Eyes High-Programms der University of Calgary und durch ein uneingeschränktes Bildungsstipendium der Multiple Sclerosis Society of Canada und Roche Canada unterstützt. VWY erhielt eine Gehaltsunterstützung aus dem Tier-1-Programm des Canada Research Chair. Diese Arbeit wurde durch Betriebsmittel des Canadian Institutes of Health Research Grant 1049959, des Multiple Sclerosis Society of Canada Grant 3236 und des US-Verteidigungsministeriums des Congressionally Directed Multiple Sclerosis Research Program unterstützt. Abbildung 1 wird mit BioRender.com erstellt. Die in dieser Veröffentlichung angepassten Zahlen wurden ursprünglich im Journal of Immunology veröffentlicht. Rajiv W. Jain, David A. Elliott und V. Wee Yong. 2023. Einzelzellanalyse von hochparametrischen histologischen Bildern mit Histoflow-Zytometrie. J. Immunol. 210: 2038-2049. Urheberrecht © [2023]. Die American Association of Immunologists, Inc.
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
Riferimenti
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