Создание и анализ гистологических изображений с высокими параметрами с помощью гистопрофлоуцитометрии
Summary
Здесь описан метод, который может быть использован для визуализации пяти или более флуоресцентных параметров с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Описан конвейер анализа для извлечения отдельных клеток из этих изображений и проведения анализа отдельных клеток с помощью стратегий проточной цитометрии, подобных гейтингу, которые могут идентифицировать подмножества клеток в срезах тканей.
Abstract
Использование гистологии для исследования разнообразия иммунных клеток в срезах тканей, таких как срезы центральной нервной системы (ЦНС), критически ограничено количеством флуоресцентных параметров, которые могут быть визуализированы за один раз. Большинство подмножеств иммунных клеток были определены с помощью проточной цитометрии с использованием сложных комбинаций белковых маркеров, часто требующих четырех или более параметров для окончательной идентификации, что выходит за рамки возможностей большинства обычных микроскопов. Поскольку проточная цитометрия диссоциирует ткани и теряет пространственную информацию, существует потребность в методах, которые могут сохранять пространственную информацию при исследовании ролей сложных типов клеток. Эти проблемы решаются путем создания метода расширения числа флуоресцентных параметров, которые могут быть отображены путем сбора сигналов спектрально перекрывающихся флуорофоров и использования спектрального расмешивания для разделения сигналов каждого отдельного флуорофора. Затем эти изображения обрабатываются с помощью конвейера анализа для получения гистологических изображений с высокими параметрами и извлечения отдельных клеток из этих изображений, чтобы уникальные флуоресцентные свойства каждой клетки могли быть проанализированы на уровне одной клетки. Используя стратегии проточной цитометрии, клетки затем могут быть профилированы на подмножества и отображены обратно в гистологические разделы, чтобы не только количественно оценить их распространенность, но и установить, как они взаимодействуют с тканевой средой. В целом, продемонстрирована простота и потенциал использования гистопроточной цитометрии для изучения сложных иммунных популяций в гистологических срезах.
Introduction
Воспаление, вызванное клетками иммунной системы и глиальными клетками, может способствовать хроническим заболеваниям ЦНС, где каждая популяция может способствовать активности другой 1,2,3. Понимание того, как иммунная система взаимодействует с этими элементами ЦНС, способствуя воспалению ЦНС, в настоящее время является основной темой интереса и в значительной степени облегчается методами с высокими параметрами, такими как секвенирование РНК одиночных клеток. С помощью секвенирования РНК одиночных клеток мы обнаружили, что существует обширная коммуникация между глиальными клетками и иммунной системой при нескольких заболеваниях ЦНС 4,5,6. Понимание того, как эти взаимодействия влияют на эти расстройства, будет иметь решающее значение для выяснения биологии этих заболеваний.
Одна из проблем с анализом секвенирования одиночных клеток заключается в том, что эти методы требуют разрушения ткани для получения отдельных клеток или ядер, что приводит к полной потере пространственной информации. Знание того, где в ткани находится клетка, имеет решающее значение для понимания роли клетки в развитии воспаления. Например, иммунные клетки, такие как В-клетки, могут концентрироваться в ЦНС во время нейровоспаления; однако они редко проникают в паренхиму ЦНС и вместо этого концентрируются в барьерах ЦНС7. Учитывая их локализацию, маловероятно, что эти клетки способствуют воспалению ЦНС, физически взаимодействуя с глиальными клетками в паренхиме ЦНС, предполагая, что любые взаимодействия, которые они могут иметь с глиальными клетками, будут происходить через секретируемые факторы. Кроме того, патология, возникающая при заболеваниях ЦНС, часто имеет структуру 8,9 таким образом, что локализация клетки в ткани может критически определить, активно ли она способствует заболеванию или является сторонним наблюдателем. Таким образом, использование пространственной ориентации для оценки роли клетки в патологии имеет важное значение.
Изучение клеток в тканях обычно осуществляется с помощью иммуногистохимии или иммунофлуоресцентной микроскопии. Проблема с этими методами заключается в том, что они обычно могут отображать только до четырех параметров одновременно. Это является основным ограничением этих методов, поскольку мы знаем из анализа проточной цитометрии и секвенирования РНК отдельных клеток, что многим популяциям клеток требуются два или более параметров для их идентификации; Кроме того, количество необходимых параметров обычно увеличивается при поиске конкретных подмножеств ячейки типа10. Таким образом, нецелесообразно использовать стандартные методы визуализации для изучения того, как подмножества клеток могут взаимодействовать в ткани.
Эта проблема была частично решена с помощью новых методов с высокими параметрами, которые могут сохранять пространственную информацию, таких как пространственное секвенирование РНК11 и визуализационная массовая цитометрия12. Несмотря на то, что эти методы ценны, у них есть несколько проблем, таких как недостаточная доступность, сведение трехмерных данных к двум измерениям и требование значительного опыта для реализации. Другой метод, известный как последовательное окрашивание, при котором ткани окрашиваются одним набором антител с последующей инактивацией предыдущего набора антител перед окрашиванием другим набором антител, позволяет достичь гистологии с высокими параметрами без необходимости использования специализированного оборудования или опыта 13,14,15. Тем не менее, последовательное окрашивание может быть чрезвычайно трудоемким и требует большого количества времени на микроскопию, что может быть непрактично для лабораторий, не владеющих персональным микроскопом. Таким образом, существует потребность в методах, которые могут расширить количество флуоресцентных параметров, которые могут быть визуализированы за один раз на микроскопах, которые широко доступны и своевременно.
После того, как данные с высокими параметрами были получены, возникает другая проблема: обычные методы анализа изображений вряд ли смогут успешно проанализировать данные. Такие методы, как ручной подсчет или пороговое значение, жизнеспособны только в том случае, если анализ состоит из одного параметра или если несколько маркеров имеют одинаковую локализацию, где подсчитываются только перекрывающиеся сигналы. Это ограничение делает традиционный анализ неадекватным для работы с наборами данных с высокими параметрами. Успешный анализ этих наборов данных был достигнут путем сегментации отдельных клеток по гистологическим изображениям и последующего проведения стратегий гейтирования, подобных проточной цитометрии, для идентификации типов клеток16,17. Тем не менее, еще одна проблема, влияющая на эти анализы, заключается в том, что они работают только для наборов данных, в которых все интересующие клетки физически отделены друг от друга, поскольку эти методы не используют методы, которые могут точно разделить клетки, находящиеся в физическом контакте. Таким образом, требуется более новый метод, который может проводить анализ отдельных клеток на срезах гистологии, даже если клетки находятся в физическом контакте.
В данной статье описывается простой протокол, называемый гистопотоковой цитометрией, которыйбыл введен ранее и расширяет число флуоресцентных параметров, которые могут быть одновременно визуализированы с помощью широко доступных микроскопов. Этот протокол работает путем окрашивания тканей спектрально перекрывающимися красителями, а затем с использованием спектральной компенсации для удаления просачивания из перекрывающихся каналов для получения прозрачных одиночных пятен. Для облегчения анализа гистологических изображений с высокими параметрами описывается подробный конвейер анализа, который извлекает отдельные клетки из срезов тканей с целью сортировки клеток в отдельные популяции с использованием стратегий гейтирования, подобных проточной цитометрии. Этот протокол работает в тканях, где клетки присутствуют диффузно, и в тканях, где клетки плотно сжаты друг с другом, что делает этот метод универсальным для изучения тканей, таких как ЦНС, как в гомеостазе, так и в нейровоспалении. Таким образом, гистопроточная цитометрия является полезным методом для изучения взаимодействий между сложными типами клеток, которым требуется несколько клеточных маркеров для определения клеток, сохраняя при этом пространственную информацию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь описывается использование гистопроточной цитометрии, метода, который был валидирован ранее18. Показано, что при окрашивании срезов тканей спектрально перекрывающимися красителями это просвечивание через каналы может быть удалено с помощью спектральной компенсаци?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим передовую платформу микроскопии Института мозга Гочкиса за инфраструктуру визуализации и опыт. RWJ был поддержан стипендией для постдокторантуры в рамках программы Университета Калгари Eyes High и неограниченной образовательной стипендией Канадского общества рассеянного склероза и Roche Canada. VWY получал заработную плату в рамках программы Canada Research Chair Tier 1. Эта работа была поддержана операционными фондами из гранта Канадского института исследований в области здравоохранения 1049959, гранта 3236 Канадского общества рассеянного склероза и Программы исследований рассеянного склероза, направляемой Конгрессом Министерства обороны США. Рисунок 1 создан с помощью BioRender.com. Цифры, адаптированные в этой публикации, были первоначально опубликованы в The Journal of Immunology. Раджив В. Джейн, Дэвид А. Эллиотт и В. Ви Йонг. 2023. Одноклеточный анализ высокопараметрических гистологических изображений с использованием гистопрофлоуцитометрии. J. Immunol. 210: 2038-2049. Авторское право © [2023]. Американская ассоциация иммунологов, Inc.
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
Riferimenti
- Bar-Or, A., Li, R. Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances. Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
- Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology. Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).
- Absinta, M., et al. A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis. Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Schirmer, L., et al. Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis. Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).
- Jain, R. W., Yong, V. W. B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology. Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).
- Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
- Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. A practitioner’s view of spectral flow cytometry. Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).
- Ramaglia, V., et al. Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry. Elife. 8, (2019).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies. J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).
- Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry. J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. , (2023).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Berg, S., et al. ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Ruhlandt, D., et al. Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity. Commun Biol. 3 (1), 627 (2020).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. 79, 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68 (2020).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
