使用 Histoflow 流式细胞术生成和分析高参数组织学图像
Summary
这里描述的是一种可用于通过免疫荧光显微镜对五个或更多荧光参数进行成像的方法。概述了从这些图像中提取单细胞并通过类似流式细胞术的门控策略进行单细胞分析的分析管道，该管道可以识别组织切片中的细胞亚群。
Abstract
使用组织学来研究组织切片（例如来自中枢神经系统 （CNS） 的组织切片）中的免疫细胞多样性受到一次可以成像的荧光参数数量的严重限制。大多数免疫细胞亚群是使用流式细胞术通过使用蛋白质标志物的复杂组合来定义的，通常需要四个或更多参数才能最终识别，这超出了大多数传统显微镜的能力。由于流式细胞术会解离组织并丢失空间信息，因此需要能够在询问复杂细胞类型的作用的同时保留空间信息的技术。这些问题在这里通过创建一种方法来解决，该方法通过收集光谱重叠荧光团的信号并使用光谱解混来分离每个单独荧光团的信号来扩展可以成像的荧光参数的数量。然后使用分析管道处理这些图像，以拍摄高参数组织学图像并从这些图像中提取单细胞，以便可以在单细胞水平上分析每个细胞的独特荧光特性。然后，使用类似流式细胞术的设门策略，可以将细胞分析成亚群并定位回组织学切片，不仅可以量化它们的丰度，还可以确定它们如何与组织环境相互作用。总体而言，证明了使用组织流式细胞术在组织学切片中研究复杂免疫群体的简单性和潜力。
Introduction
由免疫系统细胞和神经胶质细胞驱动的炎症会导致 CNS 的慢性疾病，其中每个群体都可以促进其他群体的活动 1,2,3。了解免疫系统如何与 CNS 的这些元素相互作用以促进 CNS 炎症是目前感兴趣的主要话题，并且单细胞 RNA 测序等高参数技术极大地促进了这一主题。通过单细胞 RNA 测序，我们发现在几种 CNS 疾病中，神经胶质细胞和免疫系统之间存在广泛的通信 4,5,6。了解这些相互作用如何影响这些疾病对于阐明这些疾病的生物学至关重要。
单细胞测序分析的一个问题是，这些技术需要破坏组织以获得单细胞或细胞核，从而导致空间信息的完全丢失。了解细胞在组织中的位置对于了解细胞在驱动炎症中的作用至关重要。例如，B 细胞等免疫细胞在神经炎症期间可以集中在 CNS 中;然而，它们很少进入 CNS 薄壁组织，而是集中在 CNS 屏障7。鉴于它们的定位，这些细胞不太可能通过与 CNS 薄壁细胞中的神经胶质细胞发生物理相互作用来促进 CNS 炎症，这表明它们可能与神经胶质细胞发生的任何相互作用都会通过分泌因子发生。此外，中枢神经系统疾病中发生的病理通常具有结构 8,9，因此细胞在组织中的定位可以关键地确定它是积极导致疾病还是旁观者。因此，使用空间定向来评估细胞在病理学中的作用是必不可少的。
研究组织中的细胞通常是通过使用免疫组织化学或免疫荧光显微镜来完成的。这些技术的一个问题是，它们通常只能同时对最多四个参数进行成像。这是这些技术的主要限制，因为我们从流式细胞术和单细胞 RNA 测序分析中了解到，许多细胞群需要两个或多个参数进行鉴定;此外，在查找 Cell Type10 的特定子集时，所需的参数数量通常会增加。因此，使用标准成像技术来研究细胞亚群如何在组织内相互作用是不切实际的。
通过可以保留空间信息的较新的高参数方法，例如空间 RNA 测序11 和成像质谱流式细胞术12，已经部分解决了这个问题。虽然这些技术很有价值，但它们确实存在一些问题，例如没有广泛使用、将 3D 数据简化为二维以及需要相当多的专业知识来执行。另一种称为顺序染色的技术，其中组织用一组抗体染色，然后灭活前一组抗体，然后再用另一组抗体染色，无需专用设备或专业知识即可实现高参数组织学 13,14,15.然而，顺序染色可能非常耗费人力，并且需要大量的显微镜检查时间，这对于没有个人显微镜的实验室来说可能不切实际。因此，需要能够扩大荧光参数数量的技术，这些参数可以在广泛可用且及时的显微镜上一次成像。
一旦采集了高参数数据，另一个问题就出现了：传统的图像分析方法不太可能成功分析数据。手动计数或阈值等技术仅在分析由单个参数组成或多个标记具有相同的定位（仅计数重叠信号）时才可行。此限制使传统分析不足以处理高参数数据集。通过从组织学图像中分割单个细胞，然后进行类似流式细胞术的门控策略来识别细胞类型，可以成功分析这些数据集16,17。然而，影响这些分析的另一个问题是，它们仅适用于所有感兴趣的细胞都彼此物理分离的数据集，因为这些技术没有采用可以准确分离物理接触细胞的方法。因此，需要一种更新的方法，即使细胞处于物理接触状态，也可以对组织学切片进行单细胞分析。
在本文中，描述了一种称为组织流式细胞术的简单方案，该方案之前已经介绍过18 ，它扩展了可以使用广泛使用的显微镜同时成像的荧光参数的数量。该方案的工作原理是用光谱重叠染料对组织进行染色，然后使用光谱补偿去除重叠通道的渗出，以获得清晰的单一染色。为了便于分析高参数组织学图像，描述了一个详细的分析管道，该管道从组织切片中提取单个细胞，以便使用类似流式细胞术的门控策略将细胞分选为不同的群体。该方案适用于细胞弥散存在的组织和细胞紧密压实在一起的组织，使该技术可用于研究稳态和神经炎症中的 CNS 等组织。因此，组织流式细胞术是研究复杂细胞类型之间相互作用的有用技术，这些细胞类型需要多个细胞标志物来定义细胞，同时保持空间信息。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述了组织流式细胞术的使用，这种技术之前已经验证了18.结果表明，当使用光谱重叠染料对组织切片进行染色时，可以使用光谱补偿去除跨通道的渗漏，从而比通常通过传统方法清晰分辨更多的荧光参数。由于使用传统方法难以分析高参数组织学图像，因此提供了一个分析管道来从这些图像中分割单个细胞。通过导出这些单个细胞的荧光特征，证明像在流式细胞术中进行?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Hotchkiss 脑研究所高级显微镜平台提供的成像基础设施和专业知识。RWJ 得到了卡尔加里大学 Eyes High 计划的博士后奖学金资助以及加拿大多发性硬化症协会和加拿大罗氏无限制教育奖学金的支持。VWY 获得了加拿大研究主席 Tier 1 计划的薪资支持。这项工作得到了加拿大卫生研究院研究资助 1049959、加拿大多发性硬化症协会资助 3236 和美国国防部国会指导的多发性硬化症研究计划的运营资金的支持。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。本出版物中改编的数字最初发表在 The Journal of Immunology 上。Rajiv W. Jain、David A. Elliott 和 V. Wee Yong。2023. 使用 Histoflow Cytometry 对高参数组织学图像进行单细胞分析。 免疫学杂志。210: 2038-2049.版权所有 © [2023]。美国免疫学家协会
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
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