Summary
Diseksiyon ve bireyin beyin bölgesi hücrelerinin büyüme, hücresel ve fizyolojik parametrelere soruşturma kolaylaştırır. Biz nöron zenginleştirilmiş serum serbest bir ortamda kültürler üretir primer hücre kültür için bir metodu tanımlar.
Abstract
Hipokampal nöronların fizyolojik özellikleri, yaygın olarak, özellikle öğrenme ve hafıza hipokampus katılımı nedeniyle incelenmiştir. İlköğretim hipokampal hücre kültür Nörobilimadamları bireysel hücre ve tek sinaps düzeyinde nöronların aktivitesi ve özelliklerini incelemek için olanak sağlar. Bu video, yeni doğan sıçanlardan alınan primer hipokampal hücreler izole ve büyümek nasıl göstereceğiz. Hipokampus, 2-3 dakika gibi kısa bir her yeni doğan hayvan izole edilmesi ve kültürleri iki hafta kadar devam edebilir. Biz de kısaca bu hipokampal nöronlar oranlı metrik kalsiyum görüntüleme için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu protokol, hipokampus için süreci tarif ederken, hiçbir değişiklik küçük beynin diğer bölgelerine uygulanabilir.
Protocol
Hipokampal izolasyon önce
Hipokampal izolasyon başlamadan önce tüm araçları steril olduğundan emin olun. % 70 etanol ile kültür başlığı aşağı Sprey, kaputun içindeki araçları. 10 cm Petri kapları, steril poli-L kaplı cam lamelleri, Pipet ve ipuçları, tek kullanımlık pipetler ve elektrikli bir pipet ve - 6 gerekecektir. Bu noktadan itibaren, doğru steril tekniği kullanmayı unutmayın.
- Açın ve su banyosunda 37 ° C'ye kadar ısıtılır olduğunu emin olun
- 4 saklanır aşağıdaki çözümleri ° C ihtiyaç duyulacaktır:
- Modifiye Kartal Orta (MEM)
- Neurobasal
- Hank tamponlu salin solüsyonu (HBSS)
- Borat tamponu çözümü
- Sodyum piruvat çözüm
- Distile su steril filtrelenmiş% 20 glukoz çözeltisi
- Kaputun koymadan önce% 70 etanol ile tüm şişe sprey emin olun.
- Dondurucu bu donmuş çözümleri alın ve sıcak su banyosu yer onları:
- 5 ml kısım at serumu
- B-27 takviyesi 1 ml kısım
- 1 ml 100X antibiyotik bir kısım (penisilin artı streptomisin)
- L-glutamin ve 0.5 ml kısım
- Çözümleri çözülmüş sonra, su banyosu, onları% 70 etanol ile onları aşağı sprey ve kaput koyun. Şimdi kaplama ve Neurobasal orta hazırlanabilir.
- Çözümler hazırlandıktan sonra, hipokampal izolasyon yaparken ısınmak için konteynerler sıkıca kapağı ve 37 ° C banyo koyun.
- Ayrıca, dondurucu proteaz tripsin bir kısım (% 2.5) ve su banyosu içine koyun. Tripsin sonraki adımda izole edilecektir disseke hipokampus, sindirir.
- Konik tüp 15ml alın HBSS ile doldurun ve tedavi grubu ile etiket. Bu izole hippocampi sonraki adımda toplanan olacağını burada.
Hipokampal İzolasyon
- Hipokampal izolasyon başlamak için, yeni doğan yavrular temiz ve süt bantları, plasenta ve göbek kordonu anneleri tarafından kaldırılır vardı emin olun.
- % 70 etanol, temiz ve kaput koyun, bir Petri kabındaki sprey yavrular yerleştirin. Hayvanlar kültür hemen önce ötenazi.
- Daha fazla sterilizasyon için bir çanak gelen yavru, yavru% 70 etanol içine batırın ve sonra steril HBSS iki yıkar.
- Kafası makasla vücuttan çıkarın. Aynı makas kullanarak, cilt ve kafa kesti.
- Kafatası beyin kabuğu, bir çift ince cımbız kullanarak ve küçük bir miktar steril HBSS içeren küçük bir Petri kabı içine beyin yerleştirin.
- Hemisferlerin geri soyun. Hipokampus, medial temporal lob küçük bir, denizatı şeklinde bir yapıdır.
- 3 ml, 15 ml tüp HBSS hipokampus ve yeri içine çıkarın. Her yavru bu adımları tekrarlayın ve her izole hipokampus 15 ml'lik tüp içine yerleştirin. Şimdi, tek hücre doku ayırmak zaman.
Hipokampal hücre disosiasyon
- Tüm hippocampi izole edildikten sonra, HBSS ile 4,5 ml, 15 ml tüp doldurun.
- Kaputun su banyosu, etanol ile sprey, yer ve tripsin çıkarın. Tüpe 0,5 ml tripsin ekleyin ve 37 az 15 dakika boyunca inkübe ° C
- Kaputun, tüpün dibine yerleşmiş hippocampi rahatsız etmemek için dikkatli olmak, steril bir pipet ile tüpten HBSS / tripsin çözüm kaldırmak. Yavaşça tüp ve girdap HBSS 5 ml ekleyin. 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Eski HBSS kaldırma ve taze solüsyon ile değiştirerek, bu adımı iki kez tekrarlayın.
- Dondurucu dışarı DNAz bir kısım atın. 4.5 ml HBSS hippocampi DNaz 0,5 ml ekleyin. DNAz enzim inaktivasyonu teşvik etmek için eklenir.
- Çözüm Karışım (veya yukarı ve aşağı pipetle) homojen kadar. Homojenat kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun.
- Trypan mavisiyle boyama yöntemi ile hücre canlılığı belirleyin.
- 6 ila 8 lamelleri içeren bir 10 cm Petri kabı alın ve kaplama orta 10 ml ekleyin. Lamelleri içeren çanak için istenilen sayıda hücre Pipet. Swirl hücrelerin nazikçe dağıtmak ve lamelleri örtüşme yoktur emin olun.
- Hücrelerin% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör 2-4 saat takmak için izin verin. Hücreler canlı ve ekli olduğunu onayladıktan sonra, Neurobasal orta içeren bireysel yemekleri lamelleri aktarın. Bu yemekleri kuvöz içine yerleştirin.
- Haftada bir kez, gerektiği gibi, taze Neurobasal orta ve deneysel tedaviler ile orta üçte birini değiştirin. Şimdi, bu hücrelerin kültür fonksiyonel özellikleri incelenecek hazırız.
Fura-2 Kalsiyum Görüntüleme Hipokampal Nöronlar
- Kültürlü hipokampal nöronlar, 48 saat (ama daha önce değil) in vitro sonra, kalsiyum görüntüleme deneyleri başlayabilir . Bu noktada, bu nöronların süreçleri uzatmak için başlamış olmalıdır. Kalsiyum görüntüleme için en uygun yaş aralığı in vitro 3 gün 7 .
- Fura-2 ile Yük kültürler, 37 ° 30 dakika AM ° C, 20X hedefi altında örnekleri her 150 ms kalsiyum göstergesi boya ve 512 bit ccd kamera, heyecanlandırmak için bir Xenon ark lambası kullanarak görüntülü sonra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol bir değişiklik Gary Banker ve Kim Goslin 1 yeni ufuklar açan bir çalışma olarak geliştirilmiştir . Bu kitap hücreleri kültür ilgilenen herkes için vazgeçilmez bir kaynak sadece nöron zenginleştirilmiş kültürler geçerli protokol açıklanan.
Hücre kültür en önemli üç faktör vardır: kısırlık, hız, orta seçim.
Laminar akış / Sterilite - steril kaput, aseptik şartlarda, steril bir inkübatör gereklidir. Kirlilik her adımda sadece üzerinde çalışmakta olduğunuz mevcut deney değil, aynı zamanda planlanmış olabilir sonraki çalışma zararlıdır. Bir kuluçka kontamine hale geldikten sonra, temizlenmiş ve steril hafta (veya bir ay) sürebilir. Kirlilik, görünür bir düzeyde hemen belli olmasa da, kesinlikle hücre canlılığı ve hücre fizyolojisi etkileyecektir. Sterilite zorunludur.
Hız - kültür hücreleri sağlık hücreleri bir atmosfer ve orta kontrollü bir ortam değildir süreyi kuvvetle bağlıdır. Bu nedenle, hücreleri kaplama ortamda kadar hayvan hücreleri çıkarmak için gerekli süreyi en azından esastır. Çok adım (tripsin kuluçka veya yıkandıktan zaman) değişmiş olamaz çünkü, ne değişmiş olabilir beyin hücreleri çıkarmak için gereken zaman miktarıdır. Genellikle diseksiyonu Pratik. Bu adım için gerekli süre miktarı tekrarlanabilir olması gerekir.
Orta Seçimi - çok sayıda tescilli ortamlar biri vardır Neurobasal . Neurobasal, glial klimalı ortamda kullanmanın gün önce (ayrı ayrı yapılması gereken bu kitapta Banker ve Goslin 1 tartışılmıştır) gerekli oldu . Ne olursa olsun, kullanılan orta ne olduğunu biliyoruz önemlidir. Neurobasal, B-27 gibi bir ek ile birlikte sıklıkla kullanılmaktadır. Hücrelerin özelliklerini etkileyebilir olarak bu orta ve takviyeleri bileşenleri, bilinen emin olun. Steroid hormonlar (benim laboratuarda yapılan işin büyük bir bölümünü Steroid hormonların eylemleri inceler) önlemek için serum serbest / kömür elimden / fenol kırmızısı ücretsiz orta kullanmak için laboratuvar standart bir uygulamadır. Bu kavram - Kullandığınız çözümler ne olduğunu biliyor hücre kültür tüm adımlar için kritik öneme sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JLN MH 68.347 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
