Encyclopedia of Experiments: Biology
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- 洗浄されたペレットワームから始めて、洗剤であるSDSと還元剤であるDDTを含むリシスバッファーを追加します。
次に、冷たい分離バッファーの数回のスケでリシス試薬を除去します。このバッファーは細胞死を防ぐために正しい浸透圧であることが重要です。
血清を含む培地を添加して酵素反応と抗生物質を加え、汚染を防ぎ、サンプルを数回洗浄してほとんどの破片を除去します。
最後に、重力沈降を可能にするためにチューブを氷の上に置く。キューティクルや細胞塊の残骸を含む破片は落ち着き、解離された細胞は培地の最上層に懸濁したままである。
このプロトコル例では、目的のニューロンでGFPを発現するトランスジェニックワームを解離して、それらの細胞を分離して分析します。
-動物を集めた後、5分間1,600回gで遠心分離します。上澄み物をすべて取り除き、M9培地の1ミリリットルでワームを再中断します。
1,600倍gで5分間遠心分離機を投じてワームをペレット化し、その後、SDS-DDTバッファーを200マイクロリットル加え、室温で5分間インキュベートします。
次に、800マイクロリットルの氷冷分離バッファーを加え、チューブを13,000回gで静かにフリックし、摂氏4度で1分間にミキシングしてワームをペレットします。
この遠心分離を繰り返し、洗浄プロセスを合計5回、毎回慎重に分離バッファーを除去します。
室温で10~15分間インキュベートします。チューブの底に対して200マイクロピペットチップで60~70回ピペットを上下にピペット加工して機械的な混乱を適用してください。
5~7分後、ワームの破片は目に見えてキューティクルを減少させ、細胞のスラリーが容易に見えるはずです。市販のライボヴィッツのL15培地に900マイクロリットルを加えて10%FBSとペニシリンストレプトマイシンを添加して反応を停止します。
遠心分離機は10,000倍gで、摂氏4度で5分間ペレット分離された断片および細胞を得る。1回の洗浄につき1ミリリットルの培地を使用してペレット化された細胞をさらに2倍洗浄する。
その後、約700〜800マイクロリットルの最上層を取り、マイクロ遠心分離管に移します。
