Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Comece com vermes de pelotização lavados e adicione tampão de lise contendo SDS, um detergente e DDT, um agente redutor. Isso quebra a cutícula protetora do verme expondo o corpo para dissociação celular. Evite exposição prolongada ao tampão de lise para minimizar a lise celular e a morte.
Em seguida, remova os reagentes de lise com várias lavagens de tampão de isolamento frio. É importante que este tampão seja da osmolaridade correta para evitar a morte celular. Use uma enzima protease para quebrar células para conexões celulares. Ajude o processo de homogeneização juntamente com a energia mecânica, tubondo a mistura contra a parede do tubo.
Adicione mídia contendo soro para parar a reação enzimática e antibióticos para evitar contaminação. Pelota e lave a amostra várias vezes para remover a maioria dos detritos.
Finalmente, coloque o tubo no gelo para permitir a sedimentação da gravidade. Detritos incluindo restos da cutícula ou aglomerados de células se estabelecerão, enquanto as células dissociadas permanecem suspensas na camada superior da mídia. Essas células podem ser usadas para cultivo a curto prazo ou para isolar populações celulares específicas por FACS ou imunoprecipitação.
No protocolo de exemplo, vamos dissociar vermes transgênicos expressando GFP em neurônios de interesse para isolar e analisar essas células.
- Depois de coletar os animais, centrifuá-los a 1.600 vezes g por cinco minutos. Remova todos os supernasceres e suspenda os vermes em 1 mililitro de mídia M9. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar a 1.600 vezes g por cinco minutos para pelotar os vermes. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão SDS-DDT e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, adicione 800 microliters de tampão de isolamento gelado e misture movendo suavemente o tubo. Centrífuga a 13.000 vezes g e a 4 graus Celsius por um minuto para pelotar os vermes. Remova o supernatante e lave com 1 mililitro de tampão de isolamento.
Repita este processo de centrifugação e lavagem um total de cinco vezes, certificando-se de remover cuidadosamente o tampão de isolamento cada vez. Depois disso, adicione 100 microliters de mistura de protease de Streptomyces griseus dissolvido em tampão de isolamento, à pelota.
Incubar à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Certifique-se de aplicar interrupção mecânica ao subir e descer 60 a 70 vezes com a ponta de micropipette de 200 microliteres contra a parte inferior do tubo. Para determinar o estágio da digestão, remova de 1 a 5 microlitros da mistura de digestão, solte-a em uma lâmina de vidro e inspecione-a usando um microscópio de cultura tecidual.
Após cinco a sete minutos, fragmentos de vermes devem ter uma cutícula visivelmente reduzida e um chorume de células será facilmente visível. Pare a reação adicionando 900 microliters de L15 médio de Leibovitz comercialmente disponível complementado com 10% de FBS e penicilina-estreptomicina.
Centrifugar a 10.000 vezes g e a 4 graus Celsius por 5 minutos para pelotas fragmentos isolados e células. Lave as células pelleted mais duas vezes com mídia l15 fria complementada usando 1 mililitro de mídia por lavagem. Re-suspender as células pelotas em 1 mililitro de mídia suplementada L15 e deixar no gelo por 30 minutos.
Em seguida, pegue a camada superior, que é aproximadamente 700 a 800 microliters, e transfira-a para um tubo de microcentrifuuge. Use um contador celular automatizado ou hemócito para medir a densidade celular de 10 a 25 microliters de células isoladas.
