Dissociazione a singola cellula di Caenorhabditis elegans: Un metodo per isolare le cellule vive

- Iniziare con vermi pellettici lavati e aggiungere tampone di lisi contenente SDS, un detergente e DDT, un agente riducente. Questo rompe la cuticola protettiva del verme che espone il corpo per la dissociazione cellulare. Evitare un'esposizione prolungata al tampone di lisi per ridurre al minimo la lisi cellulare e la morte.

Rimuovere quindi i reagenti di lisi con diversi lavaggi di tampone di isolamento a freddo. È importante che questo tampone sia dell'osmolarità corretta per prevenire la morte cellulare. Utilizzare un enzima proteasi per scommettere la cella alle connessioni cellulari. Aiutare il processo di omogeneizzazione insieme all'energia meccanica tubazionando la miscela contro la parete del tubo.

Aggiungere il supporto contenente siero per arrestare la reazione enzimatica e gli antibiotici per prevenire la contaminazione. Pellet e lavare il campione più volte per rimuovere la maggior parte dei detriti.

Infine, posizionare il tubo sul ghiaccio per consentire la sedimentazione gravitazionale. I detriti, inclusi i resti della cuticola o dei grumi cellulari, si depositeranno, mentre le cellule dissociate rimangono sospese nello strato superiore del supporto. Queste cellule possono essere utilizzate per la coltivazione a breve termine o per isolare specifiche popolazioni cellulari da FACS o immunoprecipitazione.

Nel protocollo di esempio, dissociamo i vermi transgenici che esprimono GFP nei neuroni di interesse per isolare e analizzare quelle cellule.

- Dopo aver raccolto gli animali, centrifugarli a 1.600 volte g per cinque minuti. Rimuovere tutti i supernatanti e sospendere di nuovo i vermi in 1 millilitro di mezzi M9. Trasferire la sospensione su un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri.

Centrifugare a 1.600 volte g per cinque minuti per pellettizzare i vermi. Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone SDS-DDT e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. I vermi dovrebbero ora apparire rugosi lungo il corpo se visti al microscopio leggero.

Aggiungere quindi 800 microlitri di tampone di isolamento ghiacciato e mescolare facendo scorrere delicatamente il tubo. Centrifugare a 13.000 volte g e a 4 gradi Celsius per un minuto per pellettare i vermi. Rimuovere il supernatante e lavare con 1 millilitro di tampone di isolamento.

Ripetere questo processo di centrifugazione e lavaggio per un totale di cinque volte, assicurandosi di rimuovere con cura il tampone di isolamento ogni volta. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di miscela di proteasi da Streptomyces griseus sciolti in tampone di isolamento, al pellet.

Incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Assicurarsi di applicare interruzioni meccaniche tubazioni su e giù da 60 a 70 volte con la punta della micropipetta da 200 microlitri contro il fondo del tubo. Per determinare lo stadio di digestione, rimuovere da 1 a 5 microlitri della miscela di digestione, lasciarlo cadere su uno scivolo di vetro e ispezionarlo utilizzando un microscopio a coltura tissutale.

Dopo cinque o sette minuti, i frammenti di verme dovrebbero avere una cuticola visibilmente ridotta e un liquame di cellule sarà prontamente visibile. Interrompere la reazione aggiungendo 900 microlitri del mezzo L15 di Leibovitz disponibile in commercio integrato con FBS al 10% e penicillina-streptomicina.

Centrifugare a 10.000 volte g e a 4 gradi Celsius per 5 minuti per pelletare frammenti e cellule isolati. Lavare le celle a pellet due volte di più con mezzi integrati L15 freddi utilizzando 1 millilitro di mezzo per lavaggio. Sospendere nuovamente le celle a pellet in 1 millilitro di mezzo integrato L15 e lasciare sul ghiaccio per 30 minuti.

Quindi, prendete lo strato superiore, che è di circa 700-800 microlitri, e trasferitelo in un tubo di microcentrifugo. Utilizzate un contatore di celle automatizzato o un emocitometro per misurare la densità cellulare da 10 a 25 microlitri di cellule isolate.