כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.
Abstract
ותאי גלייה של חוליות והן חסרי חוליות האורגניזמים חייבים לנדוד לאזורים היעד הסופי כדי ensheath ותמיכה נוירונים הקשורים. למרות ההתקדמות האחרונות נעשה כדי לתאר את ההגירה של תאים חיים גליה באגף גלמי פיתוח (1), מחקרים של<em> תסיסנית</em> נדידת תאים גליה יש מעורבים בדרך כלל בדיקה של רקמת קבוע. ניתוח מיקרוסקופי של תאים חיים ניעתי מציעה את היכולת לבחון את התנהגות הסלולר לאורך כל תהליך הנדידה, לרבות קביעת שיעור ושינויים בכיוון של צמיחה. יחד עם שימוש בכלים גנטיים, הדמיה חיה יכול לשמש כדי לקבוע תפקידים מדויקת יותר עבור גנים ספציפיים בתהליך של פיתוח. עבודות קודמות על ידי Silies<em> Et al.</em> (2) תיאר את ההגירה של גליה שמקורם גבעול הראייה, מבנה שמחבר את עין בפיתוח המוח, לתוך דיסק העין דמותי ברקמות קבוע. כאן אנו מתאר פרוטוקול לבחינת הגירה של תאים חיים אל גליה<em> תסיסנית</em> עין דמותי דיסק. אנו מנצלים את קו תסיסנית המבטא GFP ב גליה פיתוח לעקוב אחר התקדמות תא גלייה בסוג פראי בחיות מוטציה.
Protocol
חלק 1: טרום הניסוי הגדרת. שבוע מראש, חבר זבובים ליצור זחל המבטאים GFP בשליטת היזם גליה ספציפי. לצורך ניסוי אנו דמיינו GFP מתוייגים עם רצף לוקליזציה גרעיני לידי ביטוי ותאי גלייה באמצעות קוטביות הפוכה (repo) מקדם (3, 4). <li…
Discussion
בפרוטוקול זה אנו מתארים תצפית של נדידת תאים גליה לתוך הדיסק עין דמותי חיים באמצעות מיקרוסקופ. בדוגמה שלנו סוג בר (איור 1 לספירה), השתמשנו סמן GFP גרעיני לצפות תנועת התא גליה דיסק העין במשך שעה אחת. בשנת מוטציה של הגן מועמד נדרש נדידת תאים גליה כיום תחת מחקר במעבדה של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פטריק Cafferty נתמך על ידי מענק דוקטורט מן האגודה לטרשת נפוצה בקנדה.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Poly-L-lysine
Reagent
Sigma
P8920
Schneider’s Insect Media
Reagent
Sigma
S0146
Penicillin-Streptomycin
Reagent
Sigma
P4458
Insulin solution from bovine pancreas
Reagent
Sigma
I0516
Chamlide Magnetic chamber
Tool
Live cell Instrument
CM-R-10
35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip
Ultra fine clipper scissors
Tool
Fine scientific tools
15200-00
Dumont #5 forceps
Tool
Fine scientific tools
11251-20
Fluorescent microscope
Microscope
Zeiss
Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used.
Cafferty, P., Xie, X., Browne, K., Auld, V. J. Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc. J. Vis. Exp. (29), e1155, doi:10.3791/1155 (2009).