Questo video-articolo descrive, passo dopo passo, come elaborare un campione di sperma per raggiungere una buona qualità di fluorescenza<em> In situ</emIbridazione> sugli spermatozoi umani. Le preparazioni ottenute possono essere utilizzate per lo screening aneuploidia nel contesto della diagnosi clinica.
Abstract
Aneuploidie sono le più frequenti anomalie cromosomiche negli esseri umani. La maggior parte di queste anomalie derivare da errori durante il processo meiotico gametogenic nei genitori. Nei maschi umani, questi errori possono portare alla produzione di spermatozoi con anomalie cromosomiche numeriche che rappresentano un aumento del rischio di trasmissione di queste anomalie alla prole.
Per questo motivo, la tecnica di ibridazione in situ fluorescente (FISH) su nuclei degli spermatozoi è diventato un protocollo ampiamente adottato nel contesto della diagnosi clinica. Questa pratica fornisce una stima della frequenza di anomalie cromosomiche numeriche nei gameti dei pazienti che cercano di consulenza genetica riproduttiva.
Ad oggi, i cromosomi più frequentemente inclusi nell'analisi dello sperma FISH sono cromosomi X, Y, 13, 18 e 21.
Questo video-articolo descrive, passo dopo passo, come elaborare e fissare un campione di sperma umano, come decondense e denaturare la cromatina spermatica, come procedere per ottenere preparazioni FISH spermatozoi, e come visualizzare i risultati al microscopio. Note particolari delle operazioni più rilevanti sono dati per ottenere i migliori risultati.
Protocol
I. Trattamento dei campioni e la fissazione delle cellule Lasciare il campione di seme in contenitori sterili a temperatura ambiente per 20 minuti fino a liquefazione. Trasferire il campione in una provetta da centrifuga e spin è a 1000g per 5 minuti. Rimuovere delicatamente e scartare il surnatante con una pipetta Pasteur. Aggiungi una soluzione ipotonica (KCl, 0.075M) pre-riscaldato a 37 ° C, goccia a goccia, mescolando in un vortice di ottenere un volume finale di 10 ml. </l…
Discussion
Questo protocollo descrive come trattare i campioni di sperma umano per ottenere preparazioni FISH spermatozoi. Utilizzando questo protocollo è possibile analizzare le anomalie cromosomiche nei gameti maschili. Spermatozoi di screening aneuploidia ha applicazioni sia nel contesto della ricerca di base e nei consigli riproduttiva dato ai maschi infertili. Anche se nella diagnosi clinica dei cromosomi più studiati sono X, Y, 13, 18 e 21, altre sonde commerciali per una vasta gamma di cromosomi e loci sono disponibili e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Gli autori ringraziano a J. Blanco e F. Vidal per la loro supervisione e incoraggiamento, e J. Lucas per la sua assistenza tecnica.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
1,4-Dithiothreitol (DTT)
Material
Roche
10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol
Material
Roche
10708976001
Acetic acid
Material
Merck
100.063
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
20xSaline-Sodium Citrate
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II)
CEP 18/X/Y DNA probe
NP-40
LSI 13/21 DNA probe
Material
Vysis Inc.
32-161075
30-805850
30-804941
30-171077
30-804820
30-171078
Centrifuge 5804R
Tool
Eppendorf
Centrifuge tube
Material
Nunc
347856
Coplin jar (glass)
Material
Barloworld Scientific
Hellendahl (ZCT278)
Coplin jar (plastic)
Material
Deltalab
191087
Cover slips (15×15)
Material
Knittel gläser
4600115
Cover slips (18×18)
Material
Knittel gläser
4600118
Diamond pencil
Material
Hammacher
335117010
Ethanol
Material
Merck
100.983
Formamide
Material
Roche
11814320001
Freezer
Tool
Zanussi
Gloves
Material
Sanyc
101/3300
HYBrite™
Tool
Vysis Inc.
Immersion Oil
Material
Olympus
35505
Incubator
Tool
Heraeus
Methanol
Material
Merck
106.009
Micropipette
Material
Labsystems
Finnpipette (4500000)
Micropipette replacement tip
Material
Daslab
16-2001
Nail varnish
Material
Quo-cosmetics
Olympus BX60 epifluorescence microscope
Tool
Olympus
Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red.