Fluorescencia In situ (FISH) Protocolo en el esperma humano
Summary
Este vídeo-artículo describe, paso a paso, cómo se procesa una muestra de semen para lograr una buena calidad de fluorescencia<em> In situ</em> Hibridación en los espermatozoides humanos. Los preparados obtenidos pueden ser utilizados para la detección de aneuploidía en el contexto del diagnóstico clínico.
Abstract
Aneuploidías son las anomalías cromosómicas más frecuentes en los seres humanos. La mayoría de estas anomalías el resultado de errores durante el proceso de meiosis gametogénico en los padres. En los machos humanos, estos errores pueden conducir a la producción de espermatozoides con anomalías cromosómicas numéricas que representan un mayor riesgo de transmisión de estas anomalías a la descendencia.
Por esta razón, la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) en los núcleos de los espermatozoides se ha convertido en un protocolo ampliamente incorporado en el contexto del diagnóstico clínico. Esta práctica proporciona una estimación de la frecuencia de anomalías cromosómicas numéricas en los gametos de los pacientes que buscan el consejo genético reproductivo.
Hasta la fecha, los cromosomas más frecuentemente incluidos en el análisis de esperma de pescado son los cromosomas X, Y, 13, 18 y 21.
Este vídeo-artículo describe, paso a paso, cómo procesar y fijar una muestra de semen humano, cómo decondense y desnaturalizar la cromatina de los espermatozoides, la forma de proceder para obtener preparaciones de esperma de pescado, y la forma de visualizar los resultados en el microscopio. Comentarios especiales de los pasos más relevantes se dan para alcanzar los mejores resultados.
Protocol
Discussion
Este protocolo describe la forma de procesar las muestras de semen humano para la obtención de preparaciones de esperma de pescado. El uso de este protocolo es posible analizar las anomalías cromosómicas en los gametos masculinos. Los espermatozoides de detección de aneuploidía tiene aplicaciones tanto en el contexto de la investigación básica y en el consejo reproductivo dado a los hombres infértiles. Aunque en el diagnóstico clínico de los cromosomas más estudiados son X, Y, 13, 18 y 21 de otras sondas come…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Los autores agradecen a J. Blanco y F. Vidal para su supervisión y estímulo, y Lucas J. por su asistencia técnica.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
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Material | Vysis Inc. | 32-161075
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| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nunc | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15×15) | Material | Knittel gläser | 4600115 | |
| Cover slips (18×18) | Material | Knittel gläser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyc | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus | ||
| Methanol | Material | Merck | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Diaphot | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel gläser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B/Braun | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
