Summary
Abstract
בתאי גזע hematopoietic (HSC) הם אוכלוסייה נדירה של תאים pluripotent כי לשמור את כל שושלות דם מובחנים לאורך החיים של אורגניזם. ההגדרה הפונקציונלית של HSC הוא תא מושתלים שיש לו את היכולת לשחזר את כל שושלות דם של המונח הנמען מוקרן ארוך. הגדרה זו הוקמה על ידי עשרות שנות עבודה הזרע במערכות יונקים. באמצעות השתלת תאים hematopoietic (HCT) ו מניפולציות גנטיות הפוך העכבר, גורמי הרגולציה הבסיסית של הביולוגיה HSC מתחילים להיות חשפה, אבל עדיין ברובו מתחת נחקרו. לאחרונה, דג הזברה התפתחה כמודל גנטי חזק ללמוד hematopoiesis החולייתנים. הקמת HCT של דג הזברה יאפשר למדענים להשתמש בקנה מידה גדול מתודולוגיות סריקות גנטיות וכימיות זמין דג הזברה לחשוף את המנגנונים שבבסיס הרומן תקנה HSC. במאמר זה, אנחנו מדגימים את השיטה לביצוע HCT של דג הזברה מבוגר. אנחנו מראים את הנתיחה והכנת מוח דג הזברה הכליה כולה, באתר של hematopoiesis הבוגרת דג הזברה, לבין המבוא של תאים אלה תורם למחזור של דגים הנמען מוקרן באמצעות הזרקה intracardiac. בנוסף, אנו מתארים את הטיפול לאחר השתלה של דגים "טיפול נמרץ" כדי להגדיל את הבריאות לטווח הארוך. בכל טיפול, כללי עדין של הדג לפני, במהלך, ואחרי ההשתלה הוא קריטי כדי להגדיל את מספר הדגים ישרדו יותר מפעם אחת בחודש הבא את ההליך, שהוא חיוני להערכת לטווח ארוך (<3 חודשים) engraftment. נתוני הניסוי לצורך הקמת בפרוטוקול זה יפורסם במקום אחר. הקמתה של פרוטוקול זה יאפשר המיזוג בקנה מידה גדול דג הזברה גנטיקה וביולוגיה להשתלה.
Protocol
הקרנה
- WT מקרינים דגים 25Gy 2 ימים לפני ההשתלה
כליה לנתיחה
- הקורבן המספר המתאים של תורמים ניאון tricaine (~ 100 מ"ל 4mg/ml Tricaine / ליטר מים ודגים) (ממוצע של 500,000 תאים לכל דגים התורם)
- בודד כליה לתוך 0.9X PBS + 5% + 1% FCS פן סטרפטוקוקוס ("PBS +") בצינור
- להיפרד pipet 1ml, ואז בעזרת מזרק 10 מ"ל עם מחט 18 G 02/01
- העברת לתוך 50 מ"ל חרוטי ו להתמלא PBS +
- ספין למטה @ 1500rpm 8min
- יוצקים החוצה, resuspend גלולה בהיקף מסנן גדול 40micron דרך מסנן
- ספין למטה @ 1500rpm 8min
- יוצקים החוצה, resuspend ב 1ml PBS +, להעביר צינור Eppendorf
- כדי לספור: 10ul תא סול + 90ul trypan כחול (עכשיו זה מדולל 10X)
- תא 10ul סול + 90ul PBS + (עכשיו זה מדולל 10X)
- בואו לעמוד 5 דקות, להוסיף 10ul הן סול משני צדי hemacytometer
- ספירת תאים בתיבת גדול (5x5), חשבון עבור אחוז מוות אם משמעותי
- תאים / מ"ל = (מספר תאים) (10 4) (x10 דיל. גורם)
דוגמה - 60 תאים לסמוך hemacytometer הוא 6,000,000 תאים הכולל - ספין למטה מדגם @ 1500rpm 8min
- חישוב נפח resuspend גלולה כדי לקבל ריכוז מתאים של תאים
- הנפח הכולל 5ul להזריק - WKM להיות 3ul ו 2ul דם היקפיים להיות
- דוגמה - יש 6,000,000 תאים הכולל
רוצה השתלת 200,000 תאים לכל נמען
יש 20 נמענים
רוצה 66,667 תאים / ul (200,000 תאים / 3ul)
resuspend גלולה ב 90ul (6,000,000 תאים / 66,667 תאים / ul)
רק צריך 60ul על זה (20recip x 3ul)
דם היקפיים מיצוי
- הקורבן המספר המתאים של דגים WT ב tricaine (~ 100 מ"ל 4mg/ml Tricaine / ליטר מים ודגים) עבור דם המוביל (ממוצע של 2,000,000 תאים לכל תורם)
- קרישה: 1ul לדלל (3unit/ul) ב 1mL PBS +
- Pipet מעיל טיפ עם הפרין, דקירה דרך הזימים עם קצה pipet, להוסיף הדם PBS +
- ספין 1500rpm 5min, resuspend ב 1.5mL
- ספין 1500rpm 5min, resuspend ב 1mL
- סינון דרך מסנן 40micron
- ספירת תאים לעיל
- תאים / מ"ל = (מספר תאים) (10 4) (x10 דיל. גורם)
- חשבון למוות
- חישוב נפח resuspension לעיל
הזרקה
- הזרק 5ul ללב של כל נמען באמצעות מזרק המילטון
- הרדימי דגים tricaine (4.2ml (4mg/ml) Tricaine / 100 מ"ל מים דגים) ומניחים על ספוג לח
- הוספת טיפ קטן מאחורי הלב
- נקבו מסביב לאזור הלב עד שתראה התפרצות קטנה של דם (כלומר, אתה מכה את הלב) -> לא יכול לראות את זה אבל בכל מקרה להזריק
טיפול נמרץ דגים - שלאחר הזריקה
- שמור על הדגים את זרימת שבוע 1, כדי למנוע זיהום
- מכניסים לכל כלוב דגים 5-10
- הסר מת להקליט ולשמור
- שינוי ידני של מים בכל יום
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
