In vivo-achtige organotypische Murine netvlies Wholemount Cultuur
Summary
Deze video artikel demonstreert de oprichting van organotypische netvlies wholemount culturen en een Cytospin procedure voor de analyse van exogeen geïnduceerde effecten. Organotypische netvlies wholemount culturen na te bootsen van de<em> In vivo</em> Situatie en aanzienlijk vergemakkelijken de toegankelijkheid van muriene retina's voor experimentele manipulaties, terwijl het omzeilen van de nadelen van de klassieke murine diermodellen.
Abstract
Gerichte ablaties van genen en de analyse van dierlijke modellen is de klassieke strategie voor de inschrijving voor specifieke netvlies functie van een gen. Echter, transgene, netvlies-specifieke of conditionele knockout muismodellen vertonen vaak vroeg letaliteit of lijdt aan ernstige misvormingen, het voorkomen van een analyse verder dan embryonale of vroege postnatale fase.
Primaire celkweek is een alternatief voor de effecten van exogeen recombinant toegepaste factoren, overexpressie van genen of siRNA-gemedieerde gen knockdown in een gecontroleerde omgeving te onderzoeken. Gescheiden celcultuur heeft het voordeel dat de endogene signalen bereiken van de doelcellen worden verminderd, waardoor het vergemakkelijken van de identificatie van exogeen veroorzaakt effecten na farmacologische manipulatie. Er zijn echter belangrijke cel-cel interacties in eerste instantie vernietigd door enzymatische digestie of mechanische dissociatie, zelfs als re-geaggregeerde retinospheroid culturen een worden gebruikt.
Daarentegen, organotypische netvlies wholemount culturen zorgen voor een systeem te sluiten bij de fysiologische in vivo situatie met neuronale interacties en verbindingen nog steeds bewaard gebleven 2-5.
In deze video artikel bieden we een stap voor stap demonstratie van (1) de oprichting van in vivo-achtige organotypische netvlies wholemount culturen waaronder dissectie eigenaardigheden van embryonale, postnatale en volwassen muizen ogen en (2) een dissociatie en Cytospin procedure voor de analyse van neuronale apoptose en retinale celproliferatie in organotypische wholemounts, bijvoorbeeld na de cultuur in de aanwezigheid van exogeen recombinant toegepaste factoren.
Protocol
Discussion
Het voordeel van muizen organotypische netvlies wholemount culturen 2-5 meer dan dissociatie, monolaag, retinospheroid of opnieuw geaggregeerde 3D sferoïde culturen een ligt in het behoud van de neuronale interacties en verbindingen, het nabootsen van de in vivo situatie. In vergelijking met het vroegere rapporten 2, onze video artikel geeft een gedetailleerde demonstratie van de eigenaardigheden in enucleatie van muriene ogen en de dissectie van het netvlies van de versc…
Acknowledgements
De auteurs willen graag E. de la Rosa en AI Valenciano bedanken voor de eerste hulp bij de oprichting van de organotypische culturen en U. Laub en U. Gerster voor technische bijstand.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
References
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
