מאמר זה מדגים וידאו הקמת organotypic תרבויות wholemount הרשתית הליך cytospin לניתוח תופעות המושרה exogenously. Organotypic תרבויות wholemount רשתית לחקות את<em> In vivo</em> המצב להקל באופן משמעותי את הנגישות של הרשתית Murine עבור מניפולציות ניסיוני תוך עקיפת והחסרונות של קלאסית במודלים של בעלי חיים Murine.
Abstract
כריתה ממוקדת של גנים ואנליזה של מודלים של בעלי חיים היא האסטרטגיה הקלאסית עבור להרשם ספציפיים פונקציה גן הרשתית. עם זאת, מהונדס, הרשתית ספציפי או מותנה עכבר מודלים בנוקאאוט לעתים קרובות להציג הקטלניות מוקדם או סובלים ממומים קשים, מניעת ניתוח מעבר בשלבים עובריים או לאחר לידה מוקדמת.
תרבית תאים ראשונית מהווה חלופה כדי לחקור את ההשפעות של גורמים exogenously רקומביננטי מיושם, overexpression של גנים או siRNA בתיווך מציאה גן בסביבה מבוקרת. תרבית תאים ניתק יש את היתרון כי אותות אנדוגני להגיע לתאי היעד מופחתים, ובכך להקל על זיהוי תופעות מופעלות exogenously לאחר מניפולציה תרופתי. עם זאת, חשוב תאים תאים אינטראקציות נהרסים בתחילה על ידי עיכול אנזימטי או ניתוק מכני, גם אם מחדש מצטברים תרבויות retinospheroid 1 משמשים.
לעומת זאת, organotypic תרבויות wholemount רשתית לספק מערכת קרוב פיזיולוגיים במצב vivo עם אינטראקציות קשרים עצביים 2-5 נשמר עדיין.
במאמר זה אנו מספקים וידאו צעד אחר צעד הפגנה של הממסד (1) in vivo של דמוי organotypic תרבויות wholemount ברשתית כולל מוזרויות דיסקציה של העיניים Murine עובריים, לאחר הלידה למבוגרים ו (2) הליך התנתקות cytospin לניתוח של נוירונים אפופטוזיס ובחלוקה של תאים ברשתית ב wholemounts organotypic, למשל אחרי התרבות בנוכחות exogenously גורמים רקומביננטי מיושם.
Protocol
כל הציוד ריאגנטים צריך להיות סטרילי לרכוש או צריך להיות חום או קיטור מעוקר או מעוקר עם ETOH 70%. המדינה המחברים כי ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם הקהילות האירופיות Council Directive (86/609/EEC), בעקבות הנחיות של NIH לגבי טיפול השימוש בבעלי חיים הפ?…
Discussion
היתרון של 2-5 תרבויות Murine רשתית organotypic wholemount על דיסוציאציה, monolayer, retinospheroid או מחדש מצטברים תרבויות spheroid 3D 1 טמון בשימור אינטראקציות קשרים עצביים, מחקה את המצב vivo. לשם השוואה דיווחים 2 לשעבר, במאמר וידאו שלנו מספק הדגמה מפורטת של מוזרויות ב enucleation…
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות E. דה לה רוזה ו-AI Valenciano לעזרה ראשונית עם הקמתה של התרבויות organotypic ו ע ו U. לאוב Gerster לקבלת סיוע טכני.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Mice
Animal
Charles Rivers Laboratories
Dissection microscope
Tool
ZEISS
PBS
Reagent
Sigma
PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham
Reagent
Sigma
D 8900
DMEM / F-12
Apo-transferin
Reagent
Sigma
T 1147
Putrescin
Reagent
Sigma
P 5780
Sodium selenite
Reagent
Sigma
S 9133
Progesterone
Reagent
Sigma
P 6149
Gentamicine
Reagent
Invitrogen
L-Glutamine
Reagent
Invitrogen
25030-024
200 mM (100X), liquid
Bovine serum albumine (BSA)
Reagent
Roth
8076.3
30 mg/ml
Collagenase
Reagent
Sigma
C 0773
200 U/ml
Trypsin
Reagent
Sigma
T4799
From porcine pancreas; 1 mg/ml
Hyaluronidase
Reagent
Sigma
H 3884
200 mg/ml
DNase I
Reagent
Roche
1 284 932
10 mg/ml
EDTA
Reagent
Sigma
E 6511
Silicone solution
Reagent
Serva
35130
Paraformaldehyde (PFA)
Reagent
Sigma
P6148
8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).
4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride
Reagent
Sigma
D 0542
DAPI
Fluorescent Mounting Medium
Reagent
Dako
S3023
BrDU
Reagent
Sigma
B 9285
96-well plates
Tool
FALCON
3072
24-well plates
Tool
FALCON
3047
Pasteur pipettes
Tool
Brand
747720
Forceps DUMONT #5
Tool
Fine Science Tools
11252-30
bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7
Tool
Fine Science Tools
11271-30
curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors,straight, 8cm
Tool
Fine Science Tools
15000-00
fine, small straight blades
Standard scissors, straight, sharp/blunt
Tool
Fine Science Tools
14007-14
Use for decapitation or cervical dislocation
Eppendorf tubes
Tool
Eppendorf
2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin