Este artículo video demuestra el establecimiento de cultivos de retina organotípicos wholemount y un procedimiento citospina para el análisis de los efectos inducidos exógenamente. Organotípicos culturas wholemount imitar la retina<em> In vivo</em> Situación y facilitan significativamente la accesibilidad de las retinas murino de manipulaciones experimentales eludiendo las desventajas de los clásicos modelos animales murinos.
Ablaciones específica de genes y el análisis de modelos animales es la estrategia clásica para inscribir a la función de genes específicos de retina. Sin embargo, transgénicos, modelos knockout específicos retina-o condicional del ratón a menudo muestran letalidad temprana o sufren de malformaciones severas, impidiendo un análisis más allá de las etapas embrionarias o postnatal temprano.
Cultivo de células primarias es una alternativa para investigar los efectos de la aplicación exógena de factores recombinantes, la sobreexpresión de los genes o siRNA mediada por caída de genes en un ambiente controlado. Cultivo de células disociadas tiene la ventaja de que las señales endógenas alcanzar las células diana se reducen, lo que facilita la identificación de forma exógena efectos activados después de la manipulación farmacológica. Sin embargo, importantes interacciones célula-célula son inicialmente destruidas por digestión enzimática o la disociación mecánica, aunque reagrupadas culturas retinospheroid 1 se utilizan.
Por el contrario, las culturas organotípicos wholemount retina proporcionar un sistema de cerca las necesidades fisiológicas en la situación in vivo de interacciones neuronales y las conexiones de 5.2 aún se conservan.
En este artículo ofrecemos un vídeo paso a paso la demostración de (1) el establecimiento de in-vivo como organotípicos culturas retina wholemount incluyendo las peculiaridades de los ojos de la disección de embriones murinos, postnatal y adulto, y (2) un procedimiento de disociación y citospina para el análisis de las neuronas la apoptosis y la proliferación de las células de la retina en wholemounts organotípicos, por ejemplo, después de la cultura en la presencia de factores exógenos aplicados recombinante.
La ventaja de 2-5 murino organotípicos retina culturas wholemount sobre la disociación, monocapa, retinospheroid o volver a agregar las culturas 3D esferoide 1 se encuentra en la preservación de las interacciones neuronales y las conexiones, imitando la situación in vivo. En comparación con informes anteriores 2, nuestro artículo de vídeo ofrece una demostración detallada de las peculiaridades de la enucleación de ojos murino y la disección de las retinas de l…
Los autores desean agradecer a E. de la Rosa y Valenciano AI en busca de ayuda inicial con el establecimiento de los cultivos organotípicos y U. Laub y Gerster U. de asistencia técnica.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
Rotation shaker | Tool | CAT | ||
Cytospin | Tool | Thermo Scientific |