В естественных условиях подобные органотипической мышей сетчатки культуры Wholemount
Summary
Это видео статья демонстрирует создание органотипической сетчатки wholemount культур и процедуры цитоспина для анализа экзогенно индуцированных эффектов. Органотипической сетчатки wholemount культур имитировать<em> В естественных условиях</em> Ситуацию и значительно облегчить доступ к мышиной сетчатки для экспериментальных манипуляций в обход недостатки классического мышиных моделях на животных.
Abstract
Целевые абляции генов и анализ моделей на животных является классической стратегией для поступления конкретной функции сетчатки гена. Однако, трансгенные, сетчатки или конкретной условной модели нокаут мыши часто показывают ранние летальности или страдают от тяжелых пороков развития, предотвращения анализа за пределы эмбрионального или раннего постнатального этапа.
Первичные культуры клеток является альтернативой исследовать эффекты экзогенно применяются рекомбинантные факторы, избыточная экспрессия генов или миРНК опосредованного генной нокдаун в контролируемой среде. Расхождение между клеточной культуры имеет то преимущество, что эндогенные сигналы достижения целевых клеток уменьшается, тем самым облегчая идентификацию экзогенно срабатывает эффект после фармакологической манипуляции. Тем не менее, важно межклеточных взаимодействиях, первоначально уничтожены ферментативного пищеварения или механической диссоциации, даже если повторно агрегированных retinospheroid культур 1 используются.
С другой стороны, органотипической сетчатки wholemount культур обеспечивают системы, близкой к физиологической в естественных условиях ситуация с взаимодействием нейронов и связей до сих пор сохранились 2-5.
В этом видео мы предоставляем статье шаг за шагом демонстрации (1) создание в естественных условиях подобные органотипической сетчатки wholemount культур, включая вскрытие особенностей эмбрионального, послеродовой и взрослых мышиных глаз и (2) диссоциация и цитоспина процедуры для анализа нейронных апоптоза и пролиферации клеток сетчатки в органотипической wholemounts, например, после культуре в присутствии экзогенно применяются рекомбинантные факторы.
Protocol
Discussion
Преимущество мышиной органотипической сетчатки wholemount культур на протяжении 2-5 диссоциации, монослой, retinospheroid или повторно агрегированных 3D сфероида культур 1 лежит в сохранении нейронных взаимодействий и связей, имитируя в естественных условиях ситуации. По сравнени…
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Э. де ла Роса и А. И. Valenciano для начальной помощи с созданием органотипической культур и У. Лауб и У. Герстер для оказания технической помощи.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
References
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
