Summary
स्थानिक विशेष phytochrome प्रतिक्रियाओं का आणविक आधार ट्रांसजेनिक पौधों है कि एक्ज़िबिट ऊतक और अंग विशेष phytochrome कमियों का उपयोग कर जांच की जा रही है. विशिष्ट कोशिकाओं के अलगाव प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल माइक्रोएरे विश्लेषण द्वारा पीछा छंटनी स्थानिक विशेष phytochrome प्रतिक्रियाओं में शामिल जीनों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा रहा है द्वारा प्रेरित phytochrome क्रोमोफोर रिक्तीकरण का प्रदर्शन.
Protocol
1. संयंत्र विकास
- पुष्टि यूएएस - बी.वी.आर. एक्स GAL4 GFP बढ़ाने जाल अलग लाइन के रूप में 4 वर्णित (सारांश के लिए चित्र देखें 1.) और जंगली प्रकार या माता - पिता की लाइनों की धरती पर बोया जाता है, यानी ~ प्रति पंक्ति 2000 निष्फल बीज.
- संयंत्रों 5 हफ्तों के लिए मिट्टी पर हो रहे हैं 22 100 μmolm -2 एस -1 की सफेद रोशनी के तहत डिग्री सेल्सियस और नमी 70% .
2. पत्ता हेतु प्रोटोप्लास्ट अलगाव (Denecke और Vitale 9 से अनुकूलित)
- Protoplasts अलग करने के लिए, TEX बफर तैयार करते हैं. - (एन morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस, 2.56 मिमी), 0.75 ग्राम कैल्शियम क्लोराइड dihydrate (2 0.2 CaCl एच 2 हे, 6.75 3.1 छ Gamborg B5 लवण, 0.5 छ 2: 1 लीटर TEX बफर के लिए निम्नलिखित घटकों का वजन मिमी), 0.25 ग्राम अमोनियम नाइट्रेट (चार राष्ट्रीय राजमार्ग सं 3, 3.12 मिमी), 136.9 छ (0.4M) sucrose घटकों पूरी तरह से ~ विआयनीकृत, आसुत पानी के 900 मिलीलीटर (2 हे DDH) में और भंग 5,7 करने के लिए 1 के साथ पीएच लाने KOH एम. 1 लीटर और 0.2 सुक्ष्ममापी बोतल टॉप फिल्टर एक वैक्यूम पंप से जुड़ा के साथ बाँझ फिल्टर को अंतिम मात्रा लाओ.
- पौधों से हरा, स्वस्थ पत्तियों (~ पत्तियों के 250 मिलीलीटर एक बीकर में शिथिल पैक) लीजिए और ~ 40 मिलीलीटर DDH 2 हे 4 बार से कुल्ला, बाँझ DDH 2 ओ के साथ दो बार rinsing द्वारा पीछा पतली स्ट्रिप्स में एक # 20 स्केलपेल, कटौती पत्तियों का उपयोग और दो 50 मिलीलीटर बाँझ प्लास्टिक की नलियों में समान रूप से ऊतक विभाजित. 10x पत्ता पाचन शेयर (10x पत्ता पाचन शेयर समाधान समाधान के 5 मिलीलीटर विभाज्य जोड़कर 1x पत्ता पाचन मिश्रण तैयार: 2% भंग w / v R 10-Macerozyme, 4% w / ध् "Onozuka" Cellulase TEX बफर में आर-10, फिल्टर फिल्टर 0.2 सुक्ष्ममापी और -80 ° सी में 5 मिलीलीटर aliquots फ्रीज 45 मिलीलीटर ताजा TEX बफर) के साथ बाँझ. ~ प्रति 50 मिलीलीटर के लिए सभी पत्ता ऊतक को कवर ट्यूब 1x पत्ता पाचन मिश्रण के 25 मिलीलीटर जोड़ें.
- पाचन मिश्रण में खुले ट्यूब में एक निर्वात desiccator एक पानी कोमल झटकों के साथ एक घुमाव पर 3 - घंटा कमरे के तापमान पर ऊष्मायन द्वारा पीछा पंप से जुड़ा का उपयोग कर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पत्ता ऊतक घुसपैठ वैक्यूम. 1x पत्ता पाचन मिश्रण में पत्ता ऊतक के साथ छाया ट्यूबों इस प्रक्रिया के दौरान रखा जाता है एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के.
- 3 घंटे के बाद, झूली कुरसी गति ~ 2 मिनट protoplasts रिहाई के लिए वृद्धि हुई है. बाँझ पनीर कपड़े की दो परतों के माध्यम से कच्चे मूलतत्त्व निलंबन फ़िल्टर मलबे को हटाने और एक बाँझ कांच बीकर में छानना इकट्ठा. एक बाँझ नायलॉन 100 सुक्ष्ममापी जाल के माध्यम से एक बाँझ पेट्री डिश में छानना फ़िल्टर. प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए और यह एक नया बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण. ताजा TEX बफर के 15-20 मिलीलीटर के बारे में प्रयोग करने के लिए बाँझ पेट्री डिश धोने और किसी भी सतह का पालन protoplasts इकट्ठा.
- अपकेंद्रित्र 100xg में 10 पर एक स्विंग बाल्टी रोटर ° का उपयोग कर 15 मिनट (6 त्वरण, मंदी 0) के लिए सी के माध्यम से प्रवाह.
- 25 ~ निकालें - अस्थायी मूलतत्त्व परत है, जिसमें अवशिष्ट और pelleted मलबे के नीचे तरल की 30 मिलीलीटर, 15 मिलीलीटर मात्रा - एक बाँझ 9 "कांच पाश्चर चल मूलतत्त्व परत परेशान और ~ 10 छोड़ने के बिना एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से जुड़े विंदुक के साथ.
- 40 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए ताजा TEX बफर जोड़ें जबकि धीरे protoplasts resuspending.
- कदम 2,5 करने के लिए 2,7 दो बार दोहराएँ करने के लिए जितना संभव हो उतना सेलुलर मलबे को हटाने. centrifugation समय पहली पुनरावृत्ति में 10 मिनट के लिए और अंतिम पुनरावृत्ति में 5 मिनट के लिए कम है.
- , एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में बाँझ 1 मिलीलीटर हस्तांतरण विंदुक कटौती के साथ अस्थायी protoplasts Aspirate. सॉर्टिंग या अंधेरे में दुकान के लिए 2 घंटे के लिए 4 बजे ° C छँटाई जब तक सीधे आगे बढ़ें.
3. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (FACS) द्वारा हेतु प्रोटोप्लास्ट छंटनी
- सॉर्ट करने से पहले, Confocal लेज़र स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) उत्तेजना के लिए एक 488 एनएम लेजर का उपयोग करने के लिए मूलतत्त्व अखंडता और मूलतत्त्व पूल में GFP प्रतिदीप्ति की उपस्थिति की पुष्टि द्वारा जांच protoplasts. मिनिमल मलबे FACS छँटाई नोक clogging से बचने के लिए आवश्यक है.
- FACS के माध्यम से TEX बफर (बी FACSVantage एसई, बी.डी. बायोसाइंसेज) के आधार पर क्रमबद्ध पृथक protoplasts +६००० और 15,000 के बीच घटना दरों पर एक मैक्रो सॉर्ट सिर पर लगभग 9 साई के एक अनुकूलित प्रोटोकॉल 10 के बाद एक प्रणाली के दबाव के साथ एक 200-सुक्ष्ममापी नोक का उपयोग करते हुए.
- जंगली प्रकार गैर GFP protoplasts autofluorescence थ्रेसहोल्ड निर्धारित किया जाता है.
- GFP पॉजिटिव protoplasts तरह एक 488 एनएम argon लाइन पर एक एयर कूल्ड argon लेजर (स्पेक्ट्रा भौतिकी मॉडल 177, न्यूपोर्ट निगम, Irvine, CA) 100 मेगावाट पर संचालित का उपयोग GFP प्रतिदीप्ति पहचान 530/30 बैंड का उपयोग कोशिकाओं को इकट्ठा फिल्टर से गुजारें.
- GFP-सकारात्मक protoplasts के संग्रह के बाद, CLSM द्वारा 3.1 कदम में विस्तृत रूप में हल protoplasts जांच.
- सॉर्ट किया गया Qiagen RNeasy संयंत्र मिनी किट का उपयोग कर protoplasts से कुल शाही सेना निकालें. सीडीएनए तो संकरण के लिए तैयार किया जा सकता है के रूप में Affymetrix GeneChip Expr में वर्णितession विश्लेषण तकनीकी मैनुअल और फिर AtH1 Arabidopsis Affymetrix पूरे जीनोम arrays के लिए संकरित.
प्रतिनिधि परिणाम
हम FACS (छवि 2) द्वारा GFP चैनल में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या का पता चला. अनुकूलन GFP माता पिता बढ़ाने जाल, constitutively GFP-व्यक्त लाइन, J0571, प्रदर्शित ~ 17% से 24% GFP पॉजिटिव protoplasts का उपयोग करते हुए, जबकि संवहनी और चमड़े अभिव्यक्ति के साथ लाइन, J1071, ~ 1.4% GFP पॉजिटिव protoplasts था assays में (1 टेबल). 1 ज के लिए J0571 protoplasts के 3 x 500 μl (~ मूलतत्त्व निलंबन के 1.5 मिलीलीटर कुल) की छंटनी ~ 100,000 GFP सकारात्मक protoplasts दिया. 1.5 ज के लिए J1071 protoplasts के 3 x 500 μl (~ 1.5 मिलीलीटर कुल मूलतत्त्व निलंबन) की छंटनी ~ ३,००० GFP पॉजिटिव protoplasts दिया. Confocal छवियों दोनों J0571 और J1071 नमूने के लिए एक protoplasts का बहुत ही उच्च उपज का संकेत पहले छँटाई बाहर किया गया (छवि -3 सी और 3E), और भिन्न सॉर्ट किया गया केवल उज्ज्वल GFP फ्लोरोसेंट protoplasts (छवि 3 जी और डेटा नहीं दिखाया गया है) शामिल है. यह निष्कर्ष की पुष्टि करता है कि बरकरार GFP पॉजिटिव protoplasts FACS के माध्यम से हल किया जा सकता है. गैर - GFP protoplasts भी हल कर सकते हैं और हो सकता है एक अलग चैनल में एकत्र. गैर - GFP protoplasts बाद माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए एक आदर्श नकारात्मक नियंत्रण holophytochrome स्तर की कमी पर जीन अभिव्यक्ति में विशिष्ट परिवर्तन का पता लगाने के रूप में सेवा करते हैं. पृथक (1 मिलीलीटर) protoplasts fluorospectrometry (4 छवि) द्वारा पता लगाने के लिए पर्याप्त मात्रा की पैदावार शाही सेना से शाही सेना निष्कर्षण. आइसोलेटेड शाही सेना एक NanoDrop साधन (NanoDrop 1000, थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग मूल्यांकन किया गया था और NanoDrop 3.7.1 आरएनए मात्रा का ठहराव सॉफ्टवेयर द्वारा मात्रा. से शाही सेना पैदावार C24 जंगली प्रकार protoplasts या FACS सॉर्ट किया गया - GFP पॉजिटिव बढ़ाने जाल protoplasts न्यूनतम 20 में उपयोग के लिए जरूरत एनजी से अधिक पूर्व सॉर्ट किया गया शाही सेना लेबलिंग माइक्रोएरे (तालिका 2) के लिए assays.
| बढ़ाने जाल लाइन | GFP-सकारात्मक protoplasts% | सॉर्ट किया गया GFP protoplasts की संख्या |
| J0571 | 17.18% ~ 24.06% | २६,४०० ~ ३६,००० |
| J1071 | ~ 1.43% | १,००० ~ 1300 |
तालिका 1. छँटाई और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर (FACSVantage बी) के माध्यम से मूलतत्त्व निलंबन के 500 μL चलाकर GFP पॉजिटिव एकत्र protoplasts की संख्या पहले दो बढ़ाने जाल लाइनों से GFP पॉजिटिव protoplasts प्रतिशत.
| संयंत्र रेखा | शाही सेना उपज (एनजी) |
| C24 WT | 12486.5 |
| J0571 | 60 |
| J1071 | 71.5 |
टेबल 2 protoplasts से शाही सेना अलगाव से उपज. शाही सेना के पूर्व हल C24 जंगली प्रकार या दो बढ़ाने जाल लाइनों से सॉर्ट किया गया GFP पॉजिटिव protoplasts से पृथक किया गया और मात्रा निर्धारित है.
चित्रा 1. Biliverdin reductase (बी.वी.आर.) ट्रांसजेनिक पौधों Arabidopsis thaliana में अभिव्यक्ति की प्रेरण GAL4 बढ़ाने - जाल आधारित है . (ए). एक GAL4 आधारित बढ़ाने जाल लाइनों, जो एक GFP GAL4 उत्तरदायी मार्कर जीन होते हैं की एक पुस्तकालय से चयनित व्यक्ति को एक लक्ष्य GAL4 उत्तरदायी जीन युक्त लाइन में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति प्रेरित GAL4 युक्त चिह्नित कोशिकाओं के साथ पार किया जा सकता है GFP प्रतिदीप्ति के द्वारा. डॉ. जिम Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html) से एक आंकड़ा के आधार पर. (ख) माता पिता के लाइनों में phytochrome क्रोमोफोर, phytochromobilin (PΦB) और holophytochrome का उत्पादन. (सी) वाम biliverdin (BV IXα) IXα और PΦB biliverdin (बी.वी.आर.) बीआर और PΦR के लिए गतिविधि रिडक्टेस द्वारा न्यूनीकरण, क्रमशः. बी.वी.आर. PΦB की कमी में गतिविधि का परिणाम है और प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित के उत्पादन में कमी की ओर जाता है है holophytochrome. ठीक है, बी.वी.आर. द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया दिखाया गया है.
चित्रा 2 प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (FACS) छंटनी अधिग्रहण डॉट भूखंडों. मूलतत्त्व सेल की तुलना C24 जंगली प्रकार (ए), J0571 (बी) और J1071 (सी) के लिए छँटाई. (ए) का अधिग्रहण गैर GFP फ्लोरोसेंट C24 जंगली प्रकार 488 एनएम argon लेजर से उत्साहित और autofluorescence दहलीज का निर्धारण किया protoplasts डॉट साजिश. (बी) और (सी) डॉट अधिग्रहण भूखंडों protoplasts कि उत्तेजना के लिए जवाब में एक 488 एनएम लेजर द्वारा सकारात्मक GFP कर रहे हैं के अनुपात दिखा. बी और सी GFP सकारात्मक लक्ष्य है कि प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर द्वारा हल किया गया (FACSVantage बी) और एकत्र परिसीमित में R3 छँटाई फाटकों. लाल चैनल ध् इंगित करता हैprotoplasts और हरे चैनल से क्लोरोफिल autofluorescence के लिए alues GFP प्रतिदीप्ति के लिए मानों को इंगित करता है.
चित्रा 3 संयंत्र सेल छँटाई के लिए इस्तेमाल किया protoplasts के confocal माइक्रोस्कोपी. लेजर confocal (ए, सी और ई) से पहले और बाद प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) के माध्यम से छँटाई (G) protoplasts की छवियों को स्कैन. बी, डी, एफ, और एच डीआईसी छवियाँ हैं. C24 जंगली प्रकार (ए, बी), (सी, डी) J1071 और J0571 (ई, एफ, जी, एच) के Protoplasts दिखाए जाते हैं. और Autofluorescence (एल.पी. 650 एनएम) एक 488 एनएम लेजर के साथ उत्तेजना से प्राप्त छवियाँ सी, ई और जी GFP प्रतिदीप्ति (575 एनएम बी.पी. 505 एनएम) की छवियों का विलय कर रहे हैं. एच के माध्यम से 63x तेल के तहत 4 स्कैन की एक औसत रहे हैं. बार = 10 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 4 fluorospectrometry द्वारा protoplasts से अलग शाही सेना की मात्रा. शाही सेना (ए) C24 जंगली प्रकार, (बी) J0571, और (सी) J1071 से निकाले. पूर्व सॉर्ट किया गया जंगली प्रकार protoplasts के लिए शाही सेना को इंगित करता है. बी और सी GFP-सकारात्मक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (FACS) द्वारा सॉर्ट protoplasts से शाही सेना से संकेत मिलता है. शाही सेना मात्रा का ठहराव सॉफ्टवेयर, NanoDrop 3.7.1, (1000 NanoDrop, थर्मो वैज्ञानिक).
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Discussion
जीन प्रोटीन के माध्यम से अभिव्यक्ति की रूपरेखा (1) ने संकेत दिया है कि Arabidopsis seedlings में जीनों के 30% से अधिक प्रकाश विनियमित 11 कर रहे हैं और (2) प्रकाश संकेत transduction phytochrome संकेतन झरना 12, 13 में शामिल प्रोटीन एन्कोडिंग जीनों के एक विशाल समूह की पहचान की है . इस तरह के प्रयोगों का सुझाव है कि प्रकाश जीन अभिव्यक्ति में तेजी से और लंबे समय तक परिवर्तन लाती है. Phytochromes के प्रत्येक पूल के विकास और अनुकूली प्रतिक्रियाओं का केवल एक सबसेट को नियंत्रित कर सकते हैं. इसके अलावा, यह संभावना है कि बहाव के संकेत घटकों के सेल और ऊतक विशिष्ट 2 तरीके, 14, 15 में phytochromes साथ बातचीत है .
बहाव उम्मीदवार जीनों की अभिव्यक्ति हो सकता है ऊपर या नीचे विनियमित लक्षित बी.वी.आर. अभिव्यक्ति पर . यूएएस बी.वी.आर. एक्स संतान GAL4 GFP और माता - पिता की लाइनों में जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों के तुलनात्मक विश्लेषण के माध्यम से, हम जीन अभिव्यक्ति में विशिष्ट परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं, जहां स्थानीयकृत phytochrome की कमी से इस तरह के बदलाव परिणाम. जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के आधार पर, हम जीन है कि phytochrome की मध्यस्थता संकेतन सेल के लिए सेल में नकारात्मक और सकारात्मक कारकों सांकेतिक शब्दों में बदलना की पहचान कर सकते हैं. हाल के आंकड़े बताते हैं कि कई सौ टेप संयंत्र ऊतक 16 के protoplasting द्वारा प्रेरित कर रहे हैं . इस प्रकार, माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए आदर्श नकारात्मक नियंत्रण आरएनए गैर GFP छँटाई के दौरान एकत्र protoplasts से अलग है. देखिए कि संयंत्र के ऊतकों के protoplasting द्वारा प्रेरित कर रहे हैं इन नियंत्रणों का उपयोग कर डेटा विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है, लक्ष्य विशेष रूप से ऊतक और अंग विशेष phytochrome संकेतन और / या प्रतिक्रियाओं में शामिल जीनों की पहचान में जिसके परिणामस्वरूप. सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति की रूपरेखा के माध्यम से पहचान की जीन की अभिव्यक्ति में स्थिर राज्य परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए, QRT-पीसीआर पाली शाही सेना (ए) को बाहर कर सकते हैं सॉर्ट किया गया GFP-सकारात्मक और GFP नकारात्मक protoplasts से किया.
जीन जिनकी अभिव्यक्ति माइक्रोएरे विश्लेषण में काफी बदल गया है और QRT-पीसीआर द्वारा पुष्टि की असतत phytochrome की मध्यस्थता कहनेवाला संकेतन में शामिल उम्मीदवार के रूप में पहचाने जाते हैं. यदि टी डीएनए प्रविष्टि म्यूटेंट पहले से ही उम्मीदवार जीन में उपलब्ध हैं, वे प्रकाश बिगड़ा phenotypes के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. म्यूटेंट के phenotypes उम्मीदवार जीन और जंगली प्रकार के लिए जाना जाता है phytochrome म्यूटेंट में परिवर्तन ले जाने की तुलना करके, हम विशिष्ट प्रतिक्रियाओं में जो उम्मीदवार जीन नियामक भूमिकाओं की पहचान कर सकते हैं. यदि उम्मीदवार जीन में उत्परिवर्तन के साथ म्यूटेंट phytochrome की कमी phenotypes प्रदर्शन, इस की पुष्टि करेगा कि पहचान बहाव के लक्ष्य जीन अलग phytochrome विनियमित प्रतिक्रियाओं mediating में शामिल हैं.
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Acknowledgments
मोंटगोमरी प्रयोगशाला में पौधों में phytochrome प्रतिक्रियाओं पर कार्य राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान नहीं. BLM MCB-0,919,100) और रसायन विज्ञान, Geosciences और बायोसाइंसेज प्रभाग, मूल ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय, विज्ञान के कार्यालय, अमेरिका विभाग द्वारा समर्थित है ऊर्जा (अनुदान नहीं. FG02 डे BLM 91ER20021). हम शूटिंग के दौरान तकनीकी सहायता के लिए मेलिस्सा Whitaker धन्यवाद और समीक्षकों पांडुलिपि पढ़ने, प्रयोगात्मक सहायता, विकास और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल अनुकूलन सहायता के लिए confocal साथ Arabidopsis मूलतत्त्व छँटाई और डॉ. मेलिंडा फ़्रेम के लिए प्रोटोकॉल छंटनी के साथ सहायता के लिए डा. लुई राजा के लिए स्टेफ़नी Costigan माइक्रोस्कोपी. हम ग्राफिकल डिजाइन सहायता और संपादकीय सहायता के लिए करेन बर्ड के लिए मार्लिन कैमरून धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | |
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis | MSPC 0930 | |
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma-Aldrich | G5768 | |
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis | PTC 001 | |
| MES, low moisture content | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | |
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | |
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
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- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
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