Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR
Summary
Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) is een doeltreffend instrument om mRNA niveaus te diagnosticeren in verschillende insecten weefsels en ontwikkelingsstadia. In dit rapport tonen we het gebruik van de qRT-PCR na te gaan mRNA niveaus in de verschillende weefsels en larvale ontwikkelingsstadia van de invasieve soorten insecten, smaragd as boor.
Abstract
Emerald as boor (EAB,<em> Agrilus planipennis</em>) Is een exotische invasieve pest, die heeft gedood miljoenen essen (<em> Fraxinus</em> Spp) in Noord-Amerika.<strong></strong> EAB blijft snel verspreiden en aanvallen essen bomen van verschillende leeftijden, van jonge boompjes tot volwassen bomen. Echter, tot op heden weinig of geen moleculaire kennis bestaat voor EAB. Wij zijn geïnteresseerd in het ontcijferen van de moleculaire basis van fysiologische processen in het weefsel niveau dat de steun EAB in succesvolle kolonisatie van essen. In dit rapport tonen we het effectieve gebruik van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) om na te gaan mRNA niveaus in de verschillende larvale weefsels (inclusief middendarm-, vet-instellingen en cuticula) en verschillende ontwikkelingsstadia (waarvan 1<sup> St</sup> -, 2<sup> Nd</sup> -, 3<sup> Rd</sup> -, 4<sup> E</sup>-Stadia, prepupae en volwassenen) van EAB. Als voorbeeld, een peritrophin gen (hierna genoemd,<em> AP-PERI1</em>) Is een voorbeeld als het gen van belang en een ribosomale eiwit (<em> AP-RP1</em>) Als de interne controle. Peritrophins zijn belangrijke componenten van de peritrophic membraan / matrix (PM), dat is de bekleding van het insect darm. De PM heeft diverse functies, waaronder de spijsvertering en mechanische bescherming aan de middendarm epitheel.
Protocol
Discussion
De drempel cycli (Ct) waarde wordt verkregen voor elk monster in de qRT-PCR-plaat. Voor het maken van de standaard curve, is de Ct-waarde verkregen voor elke verdunning uitgezet tegen de log van de concentratie. De Ct-waarden voor de experimentele monsters werden vervolgens uitgezet op deze verdunningsreeks standaardcurve. Target hoeveelheden werden berekend op basis van aparte standaard curves gegenereerd voor elk experiment dat wil zeggen weefsel en ontwikkeling expressie. De relatieve expressie-waarden (toerental) we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de hulp van Lourdes Delta Arrueta Antequera (afdeling Entomologie, Ohio State University / OARDC, Wooster, OH) in de setup van de experimenten. Wij danken dr. Therese Polen (USDA, Bos Services, NRS) voor het versturen EAB larven monsters. Hulp van dr. Luis A Canas en Nuris M Acosta met de microscoop setup wordt gewaardeerd. De financiering voor dit project werd verstrekt door de staat en federale fondsen toegerekend aan de Ohio Agricultural Research and Development Center, The Ohio State University.
References
- Lehane, M. J. Peritrophic matrix structure and function. Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).
- Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say]. Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).
- Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol. 39, 403-413 (2009).
- Pfaffl, W. M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).
- Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. . Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).
