تحليل مزدوج الجديلة إصلاح الحمض النووي (DSB) فاصل في خلايا الثدييات
Summary
توضح هذه المقالة GFP المستندة مضان<em> في الجسم الحي</em> المقايسات التي كميا بشكل منفصل وإعادة التركيب مثلي نهاية امتماثلان الانضمام في خلايا الثدييات.
Abstract
الحمض النووي المزدوج الجديلة هي الحمض النووي أخطر الآفات التي قد تؤدي الى خسارة هائلة من المعلومات الوراثية وموت الخلايا. DSBs إصلاح الخلايا باستخدام مسارين رئيسيين : نهاية امتماثلان الانضمام (NHEJ) وإعادة التركيب مثلي (HR). غالبا ما ترتبط الاضطرابات من NHEJ والموارد البشرية مع الشيخوخة المبكرة ، وتكون الأورام ، وبالتالي فإنه من المهم أن يكون وسيلة لقياس الكمية لكل مسار إصلاح جهاز تسوية المنازعات. وقد وضعت مختبرنا يبني مراسل الفلورسنت التي تسمح للقياس الكمي للحساسية وNHEJ والموارد البشرية. تستند يبني على الجينات التي تحتوي على مواقع GFP المهندسة الاعتراف لنوكلياز داخلية I – SCEI القطع النادرة لتحريض DSBs. ويبني بدءا من GFP سلبية كما هو المعطل الجين GFP قبل اكسون إضافية ، أو عن طريق الطفرات. إصلاح الناجح للفواصل I – SCEI المستحثة بواسطة NHEJ الموارد البشرية أو يستعيد GFP الجينات الوظيفية. عدد الخلايا التي GFP ايجابية تحسب التدفق الخلوي يوفر قياس الكمي لNHEJ أو كفاءة الموارد البشرية.
Protocol
Discussion
وNHEJ الفلورسنت والمقايسات مراسل الموارد البشرية توفر وسيلة لقياس الكمي بشكل منفصل لكل مسار إصلاح جهاز تسوية المنازعات في الجسم الحي. والمقايسات حساسة للغاية ، ويمكن الكشف عن FACS موثوق بها 10 خلايا + 20000 GFP في الخلايا. يمكن تكييفها لفحوصات لقياس الأحداث إصلاح في "ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان النص الأصلي GFP – Pem1 هدية من الدكتور لى لى. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الطبية لVG إليسون وAS
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
References
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
